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关于自发荧光和非特异性染色的几个问题

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楼主

muaiyunyan_007

骨科

铁杆站友

1楼

这个帖子发布于3年零228天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。

最近在做组织和细胞爬片的免疫荧光，三标。都遇到了自发荧光的问题，请教了很多人，解决了一些问题又多出来一些问题，所以想请教下战友有没有更好的经验。我之前做过不同组织的冰冻切片，石蜡切片，别人做好的切片和自己处理的切片，发现都有很强的自发荧光，甚至还有明显的强弱变化，干扰观察。后来摸索了很久，最后基本确定是甲醛的问题，我后来用液氮直接冷冻的样本和oct包埋后放-80℃保存的标本切片，就没有明显的自发荧光了，但是又遇到新的问题，就是直接冷冻的切片细胞形态不对，我做的是肌肉组织。所以估计还是要用甲醛固定，我现在用2.6.12.24小时做不同时长的固定，想比较下背景荧光会不会少些，目前结果还没出来。但是基本可以确定的是甲醛引起的自发荧光是主要的问题，超出你的一般想象。

然后我在做细胞爬片，又遇到阴性对照时，只加二抗不加一抗，非特异性染色非常明显，我开始用的是fitc和cy3两个都很明显，后来把fitc换成488就好点了，另外cy3还是很明显，因为cy3是山羊抗小鼠，一抗是小鼠抗小鼠，所以不知道是不是因为种属引起的非特异性染色，请战友帮忙找找原因。我的方案一般是山羊血清37°封闭1小时，一抗1:100-1:250，37°封闭1-2小时，二抗1:500，37℃封闭1小时谢谢