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关于自发荧光和非特异性染色的几个问题

骨科医师 · 最后编辑于 2022-10-09 · 来自 iOS · IP 重庆重庆
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这个帖子发布于 8 年零 124 天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。
最近在做组织和细胞爬片的免疫荧光,三标。都遇到了自发荧光的问题,请教了很多人,解决了一些问题又多出来一些问题,所以想请教下战友有没有更好的经验。我之前做过不同组织的冰冻切片,石蜡切片,别人做好的切片和自己处理的切片,发现都有很强的自发荧光,甚至还有明显的强弱变化,干扰观察。后来摸索了很久,最后基本确定是甲醛的问题,我后来用液氮直接冷冻的样本和oct包埋后放-80℃保存的标本切片,就没有明显的自发荧光了,但是又遇到新的问题,就是直接冷冻的切片细胞形态不对,我做的是肌肉组织。所以估计还是要用甲醛固定,我现在用2.6.12.24小时做不同时长的固定,想比较下背景荧光会不会少些,目前结果还没出来。但是基本可以确定的是甲醛引起的自发荧光是主要的问题,超出你的一般想象。
然后我在做细胞爬片,又遇到阴性对照时,只加二抗不加一抗,非特异性染色非常明显,我开始用的是fitc和cy3两个都很明显,后来把fitc换成488就好点了,另外cy3还是很明显,因为cy3是山羊抗小鼠,一抗是小鼠抗小鼠,所以不知道是不是因为种属引起的非特异性染色,请战友帮忙找找原因。我的方案一般是山羊血清37°封闭1小时,一抗1:100-1:250,37°封闭1-2小时,二抗1:500,37℃封闭1小时 谢谢

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