【drug-news】苦参碱抑制肺腺癌A549细胞生长和诱导凋亡研究

[摘要] 目的 研究中药苦参碱对人肺腺癌A549细胞的生长抑制作用，并对其分子机制进行初步探讨。方法 观察苦参碱作用前后A549细胞的形态学改变； MTT法检测A549细胞的增殖活性；流式细胞术及Annexin V-FITC/PI 双标记法检测苦参碱作用前后细胞的周期及早期凋亡改变。结果 苦参碱对A549细胞增殖具有明显剂量和时间依赖性抑制作用，0.2、0.5及1.0mg/ml苦参碱作用48小时，A549细胞的生长抑制率分别为9.86%、39.6%和47.3%（p <0.01），72小时细胞生长抑制率分别为10.81%、44.84%、62.62%（p <0.01），48小时和72小时的IC50分别为0.8mg/ml和0.5mg/ml。细胞周期分析显示苦参碱可使S期细胞明显减少，出现G1/S期阻滞。苦参碱可诱导A549细胞早期凋亡。0.2、0.5和1.0mg/ml苦参碱作用48小时细胞早期凋亡率分别是1.58%、6.85%和17.88%，72小时细胞早期凋亡比例分别是4.54%、20.15%和38.59%，明显高于对照组细胞自发凋亡率1.06%和0.57%（p<0.05）。结论 苦参碱可显著抑制人肺腺癌A549细胞增殖，其机制与促使A549细胞发生G1/S期阻滞，诱导凋亡有关。这一研究结果，为苦参碱应用于临床肺癌综合治疗提供了实验依据。
[关键词] 苦参碱； 抗肿瘤； 非小细胞肺癌； 凋亡
[中图分类号] [文献标识码] A

前言
肺癌是世界上发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌约占肺癌的80%-85%。目前由于检测手段的限制，65%-70% 的NSCLC患者就诊时已属晚期，尽管采用了包括手术、化疗、放疗等多种综合治疗方法，患者5年生存率仍不会超过15％［1，2］，因此，寻找新的治疗方法和有效的抗癌药物对治疗肺癌具有重要意义。近几年的研究发现我国传统中药苦参碱具有较为显著的抗肿瘤活性，可抑制肿瘤细胞的增殖、转移，诱导凋亡或分化［3—5］。本研究以肺腺癌A549细胞为研究对象，采用体外细胞培养、细胞形态学、流式细胞术等方法和技术观察了苦参碱对A549细胞的体外增殖作用，并探讨了其可能的分子机制。

1 材料与方法
1.1实验材料
1.1.1 苦参碱 分子量248.36，纯度为99.9%，购自陕西省科学院西安植物园植物化学开发研究所。双蒸水配制成10 g/L的储存液于－20℃保存备用。
1.1.2 细胞株及培养 肺腺癌A549细胞株，购自中国科学院上海细胞所，于含10%胎牛血清（FCS）、青、链霉素（浓度分别为100U/ml和100μg/ml）的RPMI 1640培养基中，常规传代培养。
1.1.3 主要试剂和仪器
RPMI 1640培养基为美国GIBCO产品，三蒸水（ddH2O）配制，0.22微米（μm）滤膜抽滤灭菌，4℃保存备用；胎牛血清(FCS)购自杭州四季青生物工程材料研究所；台盼蓝染液、溴化-（4，-5二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑（MTT）均为美国Sigma公司产品；Annexin V-FITC Kit购自南京凯基生物科技发展有限公司。

1.2实验方法
1.2.1 形态学观察：对数生长期A549细胞，调整浓度为2.5×105个/ml，加入12孔细胞培养板中。实验组加入终浓度分别为0.1、0.2、0.5、1.0和1.2mg/ml的苦参碱药液，作用24小时后倒置光学显微镜下观察A549细胞形态学改变。
1.2.2 苦参碱对A549细胞作用浓度-时间曲线的测定：对数生长期A549细胞，调整浓度为2.5×105个/ml，加入12孔细胞培养板中，1ml/孔。实验组加入苦参碱药液，终浓度分别为0.2mg/ml、0.5mg/ml和1.0mg/ml，阴性对照组加人等体积RPMI 1640 培养液，每组设6个平行孔。细胞于37℃，饱和湿度，5% CO2培养箱中常规培养。每天各实验组取出一孔，台盼蓝拒染法计数活细胞，连续计数6天，绘制苦参碱对A549细胞的作用浓度和时间曲线。
1.2.3 MTT增殖实验：对数生长期A549细胞，调整浓度为3×104个/ml，接种于96孔板中，每孔200μl，实验组加苦参碱药液，终浓度分别为0.2、0.5和1.0mg/ml，阴性对照组不加苦参碱，空白对照组补充等体积RPMI 1640培养基，每组设6个平行孔。细胞于37℃，饱和湿度，5% CO2培养48hr和72hr后，吸弃上清液150μl，各孔补加RPMI 1640 培养基200μl， 5mg/ml MTT溶液20ul，继续培养4hr后离心弃上清150 μl，加入二甲基亚砜200μl，振荡器上振荡5min溶解兰色结晶，混匀后以酶标仪于570nm处读取各孔吸光度值（A570），计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率（%）=（1-（实验组A570均值/对照组A570均值））×100%。
1.2.4 细胞周期分析：对数生长期A549细胞，调整浓度为3×105/ml，加入6孔细胞培养板中，1ml/孔。实验组加苦参碱药液，终浓度分别为0.2、0.5和1.0mg/ml, 阴性对照组不加苦参碱药液，空白对照组补充等体积RPMI 1640培养基。细胞于37℃，饱和湿度，5% CO2常规培养48hr和72hr后，胰酶消化离心收集，PBS洗涤两次，70%冷乙醇固定，RNase消化，碘化丙啶（PI）室温染色30min后，流式细胞仪检测细胞周期时相分布，计算细胞增殖指数（PI）。PI（%）=（S+G2/M）/（G1+S+G2/M）×100%。
1.2.5 Annexin V-FITC/PI 双标记法检测细胞早期凋亡：收集对数生长期A549细胞，调整细胞浓度为3×105/ml，加入6孔细胞培养板中，1ml/孔，共两块板。实验组细胞加入苦参碱药液，使其终浓度分别为0.2、0.5和1.0mg/ml, 阴性对照组不加苦参碱药液，空白对照组补充等体积RPMI 1640培养基。细胞于37℃，饱和湿度，5% CO2常规培养48hr和72hr后，离心收集细胞，于结合缓冲液中重新悬浮， Annexin V和PI 4℃暗处孵育15min后, 流式细胞仪检测分析细胞早期凋亡。
1.3 统计学分析
数据用采用SPSS13.0 统计软件处理，计量资料以 ±s 表示。组间比较采用单因素方差分析，并进行组间两两比较，P<0.05 时差异有统计学意义。

2结果
2.1形态学观察：A549细胞正常状态下呈长梭形，鹅卵石样贴壁生长，融合成片，胞浆饱满，无核固缩现象，胞浆颗粒少，偶见空泡。A549 细胞经苦参碱处理后，倒置显微镜下可见细胞漂浮，不贴壁，细胞体积明显缩小，变圆，核颜色加深，折光性加强，生长受到抑制，其抑制作用呈药物浓度和时间依赖性。随苦参碱作用时间延长，加药组细胞碎片及悬浮细胞数逐渐增多，可见大部分细胞由梭形变为不规则形，胞内可见大小不等的空泡样结构，细胞核边移，但大部分细胞胞膜尚完整（图1所示）。
2.2苦参碱对A549细胞的增殖抑制作用：由图2A生长曲线可见，0.2 mg/ml以上浓度苦参碱对A549细胞增殖均有抑制作用，其作用呈一定的时间和剂量效应关系。根据生长曲线计算，苦参碱对A549细胞48h和72h的半数有效抑制浓度（IC50）约为0.8mg/ml和0.5mg/ml。MTT结果显示，苦参碱可使A549细胞代谢MTT能力的明显降低，不同浓度(0.2、0.5和1.0mg/ml)苦参碱作用48h，细胞抑制率分别为9.9%、39.6%和47.3%，作用72h，细胞抑制率分别为10.81%、44.84%和62.62%，与对照组相比差异有显著性(p<0.01) （表1，图2B所示）。
2.3不同浓度苦参碱对A549细胞周期的影响：苦参碱作用后，A549细胞G0/G1期比例明显增高，S期细胞比例降低，细胞增殖指数降低。0.2mg/ml苦参碱作用48h后对细胞周期没有明显影响，作用72h，G0/G1期细胞增多，与对照组相比差别有统计学意义（p <0.05）；0.5mg/ml及以上浓度苦参碱作用48h后即可明显使G0/G1期细胞增多，S期细胞减少，具有时间依赖性效应（p <0.05）（结果如表2，图3-4所示）。
2.4苦参碱对A549细胞的诱导凋亡的作用：0.2、0.5和1.0mg/ml苦参碱作用48hr后，A549细胞凋亡比例分别是1.58%、6.85%和17.88% ( p <0.01)，与对照组相比有显著差异（p<0.05）；作用72小时后细胞凋亡率分别是4.54%、20.15%和38.59%,明显高于对照组细胞的自发凋亡率0.57%(p<0.01)。（结果如图5所示），显示苦参碱可诱导A549细胞发生早期凋亡，且细胞凋亡作用在一定范围内与作用时间和剂量呈正相关。

3讨论：
目前人肺腺癌无论是化疗还是放疗，临床治疗效果都不显著，而A549细胞是一种代表性人肺腺癌细胞株，因此本研究选用这种最顽固的肺癌细胞作为实验细胞，通过细胞形态学、MTT细胞活力和细胞凋亡检测等实验，研究中药苦参碱对人肺腺癌细胞的体外抗癌活性。
细胞能够进行持续分裂和恶性增殖是肿瘤细胞区别于正常细胞的重要特征，因此抑制细胞的增殖、诱导凋亡就成为抗肿瘤药物治疗恶性肿瘤的主要目的。我们的研究结果表明，苦参碱能够明显抑制A549细胞的体外增殖，抑制效应具有时间和剂量的依赖性，同时可诱导细胞凋亡。光镜下观察到苦参碱处理后A549细胞形态发生不同程度改变，胞体变得不规则，失去了原有的正常形态，细胞碎片及悬浮细胞增多，胞内出现大小不等空泡样结构等。细胞生长曲线、MTT实验及细胞周期的检测显示，0.2mg/ml苦参碱对A549细胞的增殖抑制及周期改变效应并不明显，而0.5mg/ml及以上浓度的苦参碱可使A549细胞生长变慢，同时细胞增殖指数降低，且随着作用时间延长，以上效应变得更为明显。据此我们推测，苦参碱可能是通过特异性阻断细胞周期中G1/S关键点的转换，阻止细胞有丝分裂过程，从而实现对细胞周期的调控。
细胞凋亡是一个多基因参与的细胞主动自杀过程，可调控细胞增殖和死亡的动态平衡，维持细胞数目的恒定，从而防止癌症的发生[6-7]。许多抗癌药物也是通过激发细胞的凋亡途径达到抗肿瘤的目的，因此能否引起肿瘤细胞凋亡及该药物诱导肿瘤细胞凋亡能力的高低，也成为评价抗肿瘤药物疗效的重要指标之一[8]。本研究发现，0.5mg/ml苦参碱作用48小时可明显诱导A549细胞发生凋亡，且作用有时间和剂量的依赖性，具备抗癌药物的生物活性，这为苦参碱进一步应用于临床肺癌治疗提供了实验依据。 有研究显示，苦参碱可抑制A549细胞hTERT蛋白表达，推测苦参碱的生长抑制作用与hTERT表达受抑有关，苦参碱可能通过下调肺腺癌A549细胞hTERT基因表达，抑制细胞端粒酶活性，促进肺癌细胞凋亡[9]。此外，国内范临夏等人发现，苦参碱诱导A549细胞凋亡过程中发现有Bcl-2蛋白表达水平降低，Bax 和Caspase-3蛋白水平升高[10]。在细胞凋亡调控过程中，Bcl-2蛋白是主要的抗凋亡因素，能抑制多种因素引起的细胞凋亡。体内的Bcl-2和Bax主要以二聚体形式发挥作用，Bcl-2与Bax间的比值决定了细胞是否对诱导凋亡信号的刺激做出反应，从而决定了细胞的命运[11-12]。此外，细胞内Bcl-2蛋白下调还可引起线粒体内膜通透性的改变，促进线粒体释放细胞色素C，从而进一步加速细胞凋亡[13-14]。据此他们认为，细胞内Bcl-2，Bax和Caspase-3蛋白表达水平的这种规律性变化可能提示线粒体途径参与了苦参碱诱导A549细胞凋亡的分子过程。
研究中我们发现，相对于苦参碱的中效作用浓度（IC50），低的药物浓度（0.2mg/ml）作用主要表现为细胞形态及增殖活性的改变，细胞周期和凋亡改变并不明显；0.5mg/ml及以上浓度苦参碱可明显影响A549细胞周期及诱导凋亡。这可能是因为低药物浓度主要是通过发挥细胞毒作用及诱导细胞分化等机制抑制癌细胞生长，而药物作用浓度增高后可通过阻断细胞正常的有丝分裂及诱导细胞凋亡发挥抗肿瘤活性。此外，苦参碱作用初期（24h），A549细胞主要表现为对外界不利环境因素的一种被动适应，表现为细胞组成成分、结构和生化代谢等的改变，导致细胞形态的异常变化。细胞周期改变和细胞凋亡涉及细胞多种蛋白及基因表达水平的改变，是细胞适应外界环境因素变化后产生的一种主动适应过程改变，而这可能需要较高的药物浓度或较长的作用时间才能表现出来，明确这一点对于苦参碱临床使用及肿瘤治疗可能具有重要意义。
目前苦参碱对肺癌的作用研究处于起始阶段，相关分子机制有待阐明。从天然植物药物中筛选并制备有效的抗癌制剂可能将为肺癌的临床治疗开辟一条新的途径，进一步从分子水平探讨苦参碱对肺癌细胞的作用机制有其必要性和重要性。

参考文献
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表1苦参碱对A549细胞的增殖抑制作用（MTT法）( ±s, n=6)
Tab.1 Inhibitory effects of matrine on A549 cell

组别  苦参碱浓度（mg/ml）  OD570  抑制率（%）
48h

  Control  0.517±0.11  100
  0.2  0.466±0.08   9.86 a
  0.5  0.312±0.05   39.6 a
  1.0   0.272±0.01   47.3 a
72h
  Control  0.814±0.09  100
  0.2  0.726±0.06   10.81 a
  0.5  0.449±0.04   44.84 a
  1.0  0.304±0.02   62.62 a
a： p<0.01 vs 对照组

表2苦参碱对A549细胞周期影响
Tab.2 Cell cycles analysis of A549 cells treated with different concentration of matrine

分组  苦参碱浓度 （mg/ml）  各细胞周期比例（%）  细胞增殖指数（PI）
    G0/G1  S  G2/M  
48h  Control  35.49±4.36  63.82±5.21  1.32±0.06  64.14
  0.2  35.23±2.19  60.70±3.95  4.07±0.11  64.77
  0.5  43.78±3.81  55.12±4.32  1.10±0.14  55.12 a
  1.0  76.65±4.67  23.45±2.85  0.90±0.04  24.35b
72h  Control  46.23±2.34  52.07±3.45  1.70±0.11  53.77
  0.2  52.55±1.89  45.35±2.61  2.10±0.15  47.46 a
  0.5  71.58±2.22  26.52±4.7  1.90±0.21  28.42 b
  1.0  77.20±3.11  21.70±1.98  1.10±0.17  22.80 b
a：p<0.05 vs control，b：p<0.01 vs control