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求助:分子鉴定、SSCP及PCR产物分离回收

最后编辑于 2004-09-06 · IP 广东广东
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这个帖子发布于 21 年零 37 天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我现在要分子鉴定肠道几种不同的原虫,因这些原虫不好纯培养,而且多数混合感染。借鉴16S rRNA基因可用于肠道菌群分子鉴定。我想利用18S rRNA基因序列进行分类鉴定。初步设计的实验过程:
1. 分析GenBank中该类原虫(同属或同科的)的18S rRNA基因序列,设计保守引物,扩增目的片段(片段大小设为450bp,将18S rRNA序列高变区设在扩增片段的中间)。
2.利用SSCP电泳将上述PCR产物(序列等长或相当但不同源的DNA片段的混合物)分开,EB染色,切胶回收各种不同源产物。
3.用回收的不同产物作模板再次PCR扩增或直接克隆测序。

不知道这样可不可行,有什么漏洞或不足之处,还请各位指点和补充。本人不胜感激!!!!

另外,
1、将这种序列等长但不同源的DNA片段分离开,利用SSCP电泳效果如何?查文献变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)、温度梯度凝胶电泳(temperature gradient gel electrophoresis,TGGE)效果不错,但需要特殊的电泳设备,而我们实验室可以做SSCP,请教是否还有其他好的将这种序列等长但不同源的DNA片段混合物分开?
2、SSCP用EB染色,其分变率能分开多少碱基差异的片段以便切胶回收?切胶是否有困难?切下回收的单链DNA片段能否作模板用原扩增引物是否能工作?






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