【求助】关于原代培养星型胶质细胞的鉴定问题

大家好!我现在在培养原代星型胶质细胞,大概的步骤是取新生1-2天SD大鼠的皮层,纹状体,黑质,去脑膜,胰酶消化,吹打,离心,重悬,制成单细胞悬液后接种,每三天换液,7-12天后,恒温摇床尚250rpm,过夜.纯化后即传代.按理说,我所在实验室有人做过这些工作,技术还是较成熟的,尽管我是第一次做.
对于传代后的P1代细胞,本来我是想做GFAP免疫组化的,想看看到底培养的是不是星型胶质细胞,由于种种原因,一直传到第五代时才开始做,用的是兔源性GFAP一抗,二抗是FITC标记的羊抗兔荧光二抗,操作步骤应该没什么问题,结果荧光下几乎就没有标记荧光的细胞,偶尔见到几个绿色的光点,也就是说几乎就没有星型胶质细胞,弄得我很是苦恼.
我又在光镜下观察细胞,发觉形态上也不怎么像星型胶质细胞,倒有些类似成纤维细胞,总感觉这和我在培养早期的细胞不一样.现在的问题是:
1.原代培养的astro.会不会随着传代而逐渐死亡,随之成纤维细胞慢慢占据主体.或者说我取原代时脑膜就没去除干净,导致开始时astro.所占比例就不高?
2.后来发现荧光下见到的几个绿点在光镜下好像对应的是一些圆形的,固缩的细胞,这会不会就是状态不好的,为数很少的astro.?
3.我发现培养到后期的细胞立体感非常差,觉得其很薄很薄,astro.是这样吗?哪位高手有纯化后的astro.光镜照片,能否上传一两张?
4.现在我不知到底是因为我取原代出的问题还是因为传代次数太多使得astro.逐渐减少的缘故.我的课题建立在成功培养出高纯度的astro.基础上,所以现在很是着急.我还有冻存的P1代astro.建议我复苏细胞后再作一次免疫组化看看P1代astro.纯度如何吗?
恳请诸位高手不吝赐教!感激不尽!(附件里是P4代细胞的一张照片,拍照技术有些差)