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形态学与生理生化

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论坛首页  >  形态学与生理生化讨论版
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【求助】是不是目的基因本身必须含起始密码子，才能保证其克隆到表达载体后,阅读框正确,目的基因得到表达?

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楼主 yangliuqin
yangliuqin
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这个帖子发布于13年零130天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
请教各位高手,在构建表达载体时,将目的基因用限制性内切酶酶切 后,插入到表达载体的多克隆酶切位点,怎样保证阅读框正确?是不是目的基因本身必须含起始密码子，才能保证目的基因得到正确表达?谢谢!
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2006-04-16 18:30 浏览 : 4432 回复 : 7
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fjxie
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  • 2楼
目的基因一般来源于经过RT-PCR获得,一般含有起始密码子.可以在genbank先获取该基因然后在的序列序列.如果是克隆全基因序列,则在其两端设计引物(加上合适酶切位点和保护碱基).如克隆某一片段,则需要在加上合适酶切位点和保护碱基后加上起始密码和终止密码.并确保该开放读码框架(ORF)内的碱基数是3n(确保不会引起移码突变)!
2006-04-17 00:39
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olivercyber
olivercyber
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  • 3楼
首先，要插入的目的基因序列的读码框必须是正确的。

为了将这一基因序列插入表达载体，通常要在序列两端添加合适的酶切位点，以便同表达载体相连接。常用的酶切位点通常是六碱基的酶切位点，所以添加到序列一端不会影响读码框。如果需要识别序列和切割序列特殊的酶切位点就需要注意读码框移码的问题（可以在序列中添/减碱基来保持部发生移码）。

表达载体上（无论真核还是原核）通常已经有转录起始位点，经常放在多克隆位点5'末端的酶切位点中，例如Nde I位点（CAT ATG），Nco I位点（CC ATG G）。并且在周围巧妙地设计一些辅助序列，例如原核表达所需要的SD序列，真核表达所需要的Kozack序列。而多克隆位点中其他的酶切位点通常位于这类酶切位点下游。 所以一般来说，只要将目的基因序列（当然读码框先是正确的）插入多克隆位点即可。

需要注意的是，插入的基因序列前的酶切位点序列也将参与转录和翻译，也就是说，得到的蛋白可能是N端融合了若干个非目的蛋白编码的氨基酸。 当然这可以通过设计解决，例如插入序列5’端使用NdeＩ或NcoI酶切位点。

有关蛋白表达，下面是一些有用的链接，供参考。

原核表达和真核表达的优缺点
http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/2430528_0.html

NOVAGEN原核表达宝典英文版 （也可以到novagen 公司网站上下载）
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=5212258&sty=3&keywords=%D4%AD%BA%CB%B1%ED%B4%EF

原核表达集锦
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=792324&sty=1&tpg=2&age=-1

原核表达研究者关心的10个问题
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=1300870&sty=1&tpg=2&age=-1

当然，还有这些资源的老窝，蛋白技术讨论版精华区
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=5749998&sty=3&keywords=%D4%AD%BA%CB%B1%ED%B4%EF+%BE%AB%BB%AA
2006-04-17 00:56
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olivercyber 编辑于 2006-04-17 01:03
  • • 没有培训没有证，西医开了中成药也不能报销
楼主 yangliuqin
yangliuqin
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  • 4楼
非常感谢二位的指点.另外,我想进一步请教,若克隆基因的一个片段,在酶切位点后加入ATG,如果载体本身含起始密码,则两个ATG是否影响基因的表达?再次感谢.
2006-04-18 14:54
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