【资料】综述：硫酸类肝素蛋白多糖与蛋白尿
发布于 2006-12-24 · 浏览 2363 · IP 上海上海
这个帖子发布于 18 年零 151 天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
硫酸类肝素蛋白多糖与蛋白尿
肾小球滤过屏障由多孔的内皮细胞、基底膜（GBM）、足细胞及其足突之间的裂孔隔膜构成。GBM作为滤过屏障的重要组成部分，由多种细胞外基质（ECM）包括Ⅳ型胶原（collagenⅣ）、层粘连蛋白（Laminin）及硫酸类肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteoglycans，HSPGs）交互作用形成独特的分子筛结构，能够从分子大小和电荷选择性上限制肾小球的滤过功能。足细胞和内皮细胞表面分布着HSPGs，它不仅可与GBM成分相互作用，起着“分子锚”的作用；还可与多种有着重要生物学功能的生长因子包括EGF（表皮生长因子）、FGF（成纤维细胞生长因子）等相作用而参与肾小球内的炎症反应。HSPGs表达分布的改变影响着肾小球滤过功能。近年来围绕HSPGs与蛋白尿的发生机制研究越来越多，本文就此做一综述。
1. 肾小球中HSPGs的分布与功能
肾小球中富含多种不同的HSPGs成分，并分别在肾小球内不同部位呈现不同程度的表达分布。HSPGs共同的分子结构特征为核心蛋白及与之相连的葡聚糖胺侧链，在成熟的GBM中主要由硫酸类肝素（HS）侧链与核心蛋白结合，而硫酸软骨素、硫酸角质素、硫酸皮肤素或透明质酸糖胺等较罕见[1]。HSPGs分子间存在复杂的交联作用，有着不同的蛋白水解酶特性，其HS侧链的分子大小和空间结构的异质性而使电泳特性多变，因而确定GBM中HSPGs分子构成相当困难[1]。目前已知的参与GBM构成的HSPGs包括基底膜蛋白多糖（perlecan）、集聚蛋白（agrin）、ⅩⅧ 型胶原（collagenⅩⅧ）；而肾小球固有细胞（包括足细胞、内皮细胞、系膜细胞）表面表达分布的HSPGs包括syndecan、glypican、betaglycan、CD44。
1.1. Perlecan 是最早发现的基膜成分中的HSPGs，并因其在电镜下串珠样影像而得名。Perlecan在机体的许多脏器中的内皮基膜中广泛表达，参与着炎症反应、血管生成、血栓形成等多种病理生理过程。在肾脏发育的囊胚期即可发现GBM上perlecan的表达，在发育成熟的肾脏中perlecan主要在系膜区、袍曼氏囊和肾小管的基膜表达，免疫电镜显示perlecan在GBM近内皮细胞侧局限分布[2]。Perlecan由HSPG2基因编码，定位与1号染色体短臂（1p35~p36.1）。它的核心蛋白（467kD）由5个结构域组成，位于N 端的结构域Ⅰ含有3个相邻的类肝素葡聚糖胺侧链结合位，位于C端的结构域Ⅴ也可由1个同样的结合位，偶尔也可发现结构域Ⅳ上结合硫酸软骨素多糖侧链[3,4]。Perlecan分子中特异的HS侧链结构域对其生物学功能的发挥至为关键。
Perlecan的HS侧链携带的负电荷对肾小球滤过屏障功能中电荷选择性滤过具有重要意义。在实验动物模型小鼠（HSPG2△3/△3）中发现，当其perlecan分子结构域Ⅰ中HS侧链先天缺陷时，小鼠肾脏GBM上硫酸软骨素蛋白多糖表达增加，生理状态下无异常蛋白尿发生，但予高蛋白负荷时即发生蛋白尿[5]。Perlecan依赖其HS侧链与其它GBM成分laminin、 collagenⅣ、entactin/nidogen、 fibulin结合[6]；与ECM成分纤维连接蛋白（fibronectin）结合[7]；依赖其C端结构域与GBM中另一类HSPG组分collagenⅩⅧ 结合[8]；依赖其分子中多个lamininG结构域与足细胞基底侧蛋白α-dysroglycan结合[9]；内皮细胞表面表达的perlecan参与FGF-2与其受体结合而介导内皮细胞有丝分裂信号[10]；因而perlecan在肾小球滤过屏障中多种细胞和基质成分的交互作用的网络中起着重要的调节作用。
1.2. Agrin 是近年来逐渐被认识的GBM富含的HSPGs成分之一。Agrin在神经肌接头部位的表达研究十分深入，它控制神经细胞突触的形成及功能发挥，参与血脑屏障发育过程并影响其通透功能[11]。同时也发现agrin在全身微血管部位的表达；在肾脏中GBM表达最丰富，而肾小管、袍曼氏囊及小血管部位极少表达，免疫电镜显示agrin在GBM全层均质的沉积[2,12]。Agrin由AGRN基因编码，紧邻perlecan编码基因定位于1p36.1-1pter，其基因序列上有x、y、z三个剪切位点，在不同的组织中可发现不同片段大小的同源异形体 [13]。
Agrin依赖其分子N端有laminin结合区(laminin-binding domain)与laminin结合而锚定于GBM，并通过分子中心部位2个HS侧链决定影响着GBM的电荷分布[6]。Agrin在肾小球滤过屏障中足细胞和内皮细胞的细胞表面与GBM交界面，参与着细胞对基质的黏附。Agrin通过分子C端的3个类laminin结构域（laminin-like domain）可与足细胞基底侧dysroglycanα/β复合体中α亚单位结合，并通过dysroglycan与肌营养不良蛋白-糖蛋白的复合体（dystropin-associatecd glycoprotein complex，DGC）而与足细胞骨架F-actin相连结[14]。Agrin的类laminin结构域可与足细胞基底侧整合素integrin αⅤβ1 结合，通过整合素介导细胞骨架α-actin及F-actin与GBM的结合[15]。此外，agrin分子中N端结构域与laminin的结合，并由laminin介导与足细胞表面dysroglycan及integrin αⅤβ1复合体的结合，同样地使足细胞细胞骨架与GBM成分形成紧密的结合体[6]。Agrin参与的上述足细胞及足突对GBM的紧密吸附对肾小球在高灌注压下维持其有效的滤过功能十分重要。
Agrin在基因编码修饰过程中产生的y插入位点的四肽决定簇决定着它与肝素的结合力，而与肝素的这种结合可抑制agrin与α-dysroglycan的结合[16]。但目前对肾脏表达的agrin是否具有这种特异的y插入片段尚有争议[12]。
1.3. CollagenⅩⅧ 在肾脏系膜区表达更多于在GBM的表达。collagenⅩⅧ分子N端有3个HS侧链结合区域；在基因编码修饰过程中可出现长或短的N端片段产物，而在肾脏主要表达短N端片段产物；其C端剪切后产物即为内皮他汀（endostatin），在GBM与perlecan共定位表达，能够抑制内皮细胞增生和迁移[17]。
1.4. Syndecans 家族作为跨膜分布的HSPGs，其共同的结构特征位胞外区（含HS侧链结合位点）、跨膜疏水区及短胞浆区。在肾脏只发现了syndecan-1及syndecan-4的表达，syndecan-1分布在足细胞基底侧，syndecan-4主要分布在肾小球内皮细胞，并特异地介导内皮细胞与ECM的黏附及迁移，在内皮细胞损伤及炎症反应中起着重要功能[18,19]。
1.5. Glypicans在胚胎发育的不同阶段、不同的脏器组织呈现不同的表达分布而参与着形态学发育过程，在肾脏发育过程中发现了glypican-1、glypican-3、glypican-4、glypican-5的表达[20]。目前对其在功能的研究尚不深入。
1.6. Betaglycan是TGFβ的Ⅲ型受体，在皮质肾间质、微血管内皮细胞及足细胞表达。Betaglycan分子中HS侧链及硫酸软骨素侧链并不影响与TGFβ的结合。Betaglycan以受体依赖方式调节TGFβ在炎症反应及间质纤维化过程中的生物学效应[21]。
1.7. CD44分布在内皮细胞及系膜细胞表面。在编码翻译过程中存在多种同源异形体，并可具有HS侧链或硫酸软骨素侧链。CD44作为一种细胞表面透明质酸受体，参与炎症趋化过程[22]。
2. 肾小球中HSPGs与蛋白尿
蛋白尿是肾小球疾病最常见的表现，而蛋白尿本身就是慢性肾脏疾病进展的一项持久的独立危险因素。肾小球滤过屏障的异常与蛋白尿发生密切相关，肾小球中HSPGs结构和功能的改变在蛋白尿发生和进展中起着关键作用。
2.1. HSPGs的HS侧链对肾小球选择性滤过功能的影响
许多研究证实了GBM上HSPGs的HS侧链决定着肾小球电荷选择性滤过功能。动物实验中发现应用肝素酶水解HS侧链后GBM对白蛋白和铁蛋白滤过增加[23]；给实验大鼠注射特异的HS侧链的单克隆抗体可发生急性的一过性的蛋白尿[24]；在以蛋白尿为特征的肾小球疾病如微小病变、膜性肾病、糖尿病肾病，阿霉素肾病大鼠模型及海曼肾炎大鼠模型中，应用阳离子探针给PEI（多聚氮丙啶）染色方法证实GBM部位HS相关的负电荷位点减低，且白蛋白漏出率与GBM上HS染色强度相关[25]。此外HS侧链作为GBM中不同HSPGs成分之间的交联作用位点，对维持GBM的稳定十分重要，因而同时维持了肾小球机械屏障功能。
HSPGs的HS侧链参与蛋白尿发生的机制推测可能与以下三方面有关：⑴免疫复合物对HS侧链的遮蔽作用。在狼疮性肾炎中，体内体外实验均证实了自身免疫产生的抗核小体抗体可与GBM上HS侧链结合形成复合体，尽管HS侧链表达量未改变，但受自身抗体复合物的遮蔽作用而不能发挥负电荷屏障功能，产生蛋白尿 [26]。应用肝素治疗可减少免疫复合物的局部沉积，改善HS侧链在GBM分布的减低，降低蛋白尿[27]。⑵炎症反应及自由基作用下HSPGs分子的解聚。阿霉素诱导肾病大鼠模型和嘌呤霉素诱导肾病大鼠模型中药物诱导产生的自氧由基（•OH），海曼肾炎模型中补体激活途径中产生的氧自由基，缺血损伤模型黄嘌呤氧化酶产生的氧自由基均可对蛋白多糖分子中HS侧链产生解聚作用，从而改变了电荷分布[28]。在阿霉素诱导肾病大鼠模型、STZ诱导糖尿病大鼠模型及SLE大鼠模型中应用肝素可起到抗氧化剂作用，改善电荷屏障的损害并减轻蛋白尿[29]。此外由于HS侧链解聚后，先前与HS侧链连结的相关蛋白分子如FGF、PDGF等从GBM中“静止态”被释放，与肾小球固有细胞或循环中炎症细胞作用而参与了炎症反应过程。⑶蛋白水解酶的分解作用。炎症反应中中性粒细胞和活化的血小板均可释放丝氨酸水解酶、组织蛋白酶及肝素酶而分解HS侧链与核心蛋白的结合，而产生蛋白尿[30]。
2.2. 不同病理改变的肾小球疾病中HSPGs的表达变化
2.2.1. 糖尿病肾病（DM） 目前有关HSPGs与DN蛋白尿发生关系的研究较为深入。在DN的GBM增宽同时伴有HS染色减低，硫酸化程度减低，且与蛋白尿程度相关[31]。体外培养的足细胞或系膜细胞在高糖培养条件或糖基化产物作用下，均可发现perlecan及agrin核心蛋白合成减少[32，33]。临床上应用肝素治疗可改善GBM的增宽和负电荷位点的减少，并减轻蛋白尿[34]。
2.2.2. 微小病变（MCD）儿童原发性肾病综合征中85%为MCD，以电镜下足突广泛融合及大量蛋白尿为特征。MCD肾组织中也发现GBM负电荷染色的减低，但免疫组化技术下HS染色减低同时并未发现agrin核心蛋白沉积减少[35]。将MCD患者外周血淋巴细胞、单个核细胞与大鼠足细胞及系膜细胞体外共培养，发现特别是外周血单个核细胞分泌的上清成分能够抑制HS侧链合成，但在复发组和缓解组中无差异；在IgA肾病、膜性肾病患者中则未发生如此改变[36]。环孢霉素A可改善MCD患儿血液成分诱导的HS合成障碍,[37]。
另有部分研究者对肝素酶对HSPGs水解作用在蛋白尿中的机制展开了研究。在儿童激素敏感型MCD患者中，发现其外周血单个核细胞的肝素酶表达减低，且复发组显著低于缓解组；而尿液中肝素酶明显增高，且复发组显著高于缓解组；而在成人激素敏感型MCD患者中外周血单个核细胞的肝素酶表达减低，尿液中肝素酶明显减低，但复发组与缓解组无差异 [38]。在儿童激素敏感型MCD中血液和尿液中肝素酶的不平衡现象，提示着可能存在肾脏原位产生的肝素酶，或者可能在肾脏局部还有其它因素影响着肝素酶活性的发挥。嘌呤霉素肾病大鼠模型中即发现在足细胞上肝素酶的表达与蛋白尿的相关性[39]。在高表达肝素酶的转基因大鼠中也发现了肝素酶局部表达增高与蛋白尿的相关[40]。因而，肾脏局部产生或释放的肝素酶可能作为一种致病性体“通透因子”，通过HS侧链的降解而改变电荷屏障，参与了MCD中蛋白尿的发生。
2.3. Denys-Drash 综合征（DDS）是一种由于WT-1基因杂合子突变造成的遗传性疾病，表现为Wilms’瘤伴发严重的肾病综合征及性腺发育障碍。在弥漫硬化的肾小球中GBM的HS含量减低，而硫酸软骨素含量增加，其agrin核心蛋白表达并未改变[41]。但目前WT-1表达障碍与HSPGs表达的关系尚不清楚。
2.4. 先天性肾病综合征（芬兰型，CNS-F）是一种由于NPHS1基因编码的裂孔隔膜蛋白nephrin表达异常造成的遗传性肾病，表现为婴幼儿期严重的肾病综合征。在足突广泛融合的同时，伴有GBM上HS含量减低，而硫酸软骨素含量增加[42]。但目前nephrin表达障碍与HSPGs表达的关系尚不清楚。
2.5. 肾小球肾炎（glomerulonephritis）HSPGs参与了炎症反应过程中的各个环节，包括白细胞和内皮细胞的激活、滚动迁移、黏附，白细胞从血管中的渗出等过程。同时炎症反应中内皮细胞和白细胞产生释放的肝素酶活性也明显增高，使多种HS侧链结合的生物活性物质释放而参与了炎症反应。在不同的增生性肾小球炎症中均可发现肾小球局部HS侧链染色减低，agrin表达减低，而细胞表面CD44表达增高[43]。因而，不少研究者在研究HSPGs在肾脏局部的抗炎机制同时，更关注肝素制剂在肾小球疾病中的治疗效应。肝素除了抗凝作用还可在肾脏发挥独立的抗炎效应：肝素可依赖分子中C6位的硫酸基阻断选择素P/L诱导的细胞黏附[44]，低分子肝素可抑制TNF-α介导的白细胞滚动、黏附及组织浸润等过程[45]；肝素可抑制中性粒细胞、淋巴细胞及、内皮细胞及血小板释放肝素酶的活性[46]。有研究者在慢性进展肾炎动物模型中应用硫酸化的透明质酸，发现选择素P依赖的白细胞在肾小球的浸润受到抑制，蛋白尿减轻[47]。因而，对HSPGs在慢性肾脏炎症中病理机制的研究，为慢性肾脏疾病治疗开辟了新的思路。
参考文献
1. Miner JH. Renal basement membrane components[J]. Kidney Int.1999,56(6):2016-2024
2. Groffen AJ, Ruegg MA, Dijkman H, et al. Agrin is a major heparan sulfate proteoglycan in the human glomerular basement membrane [J]. J Histochem Cytochem, 1998, 46(1) 19-27
3. Cohen IR, Grassel S, Murdoch AD, et al. Structural characterization of the complete human perlecan gene and its promoter [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1993, 90(21):10404-10408
4. Murdoch AD, Dodge GR, Cohen I, et al. Primary structure of the human HSPG from basement membrane (HSPG2/perlecan).A chimeric molecule with multiple domains homologous to the low density lipoprotein receptor, laminin, neural cell adhesion molecules, and epidermal growth factor[J]. J Biol Chem,1992,267(12):8544-8557
5. Morita H, Yoshimura A, Inui K, et al. Heparan sulfate of perlecan is involved in glomerular filtration[J]. J Am Soc Nephrol,2005,16(6):1703-1710
6. Tsen G, Halfter W, Kroger S, et al.. Agrin is a heparan sulfate proteoglycan [J]. J Biol Chem. 1995,270 (7):3392-3399
7. Heremans A, De Cock B, Cassiman JJ, et al. The core protein of the matrix-associated heparin sulfate proteoglycan binds to fibronectin[J]. J Biol Chem,1990,265(15):8716-8724
8. Mongiat M, Sweeney SM, San Antonio JD, et al. Endorepellin, a novel inhibitor of angiogenesis derived from the C terminus of perlecan[J]. J Biol Chem,2003,278(6):4238-4249
9. Brown JC, Sasaki T, Gohring W, et al. The C-terminal domain V of perlecan promotes beta1 integrin-mediated cell adhesion, binds heparin, nidogen and fibulin-2 and can be modified by glycosaminoglycans[J]. Eur J Biochem, 1997, 250(1):39-46
10. Guillonneau X, Tassin J, Berrou E, et al. In vitro changes in plasma membrane heparan sulfate proteoglycans and in perlecan expression participate in the regulation of fibroblast growth factor 2 mitogenic activity [J]. J Cell Physiol, 1996,166(1):170-187
11. Denzer AJ, Gesemann M, Ruegg MA, et al. Diverse functions of the extracellular matrix molecule agrin[J]. Sem in Neurosci, 1996,8(6): 357-366
12. Groffen AJ, Buskens CA, van Kuppevelt TH, et al. Primary structure and high expression of human agrin in basement membrane of adult lung and kindey. Eur J Biochem, 1998,254(1):123-128
13. Rupp F, Ozcelik T, Linial M, et al. Structure and chromosomal localization of the mammalian agrin gene[J]. J Neurosci, 1992, 12(9):3535-3544
14. Gesemann M, Brancaccio A, Schumacher B, et al. Agrin is a high-affinity binding protein of dystroglycan in non-muscle tissue[J]. J Biol Chem, 1998,273(1):600-605
15. Martin PT, Sanes JR. Integrins mediate adhesion to agrin and modulate agrin signaling[J]. Development, 1997,124(19):3909-3917
16. O’Toole JJ, Deyst KA, Bowe MA, et al. Alternative splicing of agrin regulates its binding to heparin α-dysroglycan, and the cell surface. Proc Natl Sci USA, 1996;93(14):7369-7374
17. Rosenzweig LJ, Kanwar YS. Removal of sulfated (heparin sulfate) or nonsulfated(hyaluronic acid) glycosaminoglycans results in increased permeability of the glomerular basement membrane to 125-I-bovine serum albumin.Lab Invest,1982,47(2):177-184
18. Van den Born J, van den Heuvel LP, Bakker MA, et al. A monoclonal antibody against GBM heparan sulfate induces an acute selective proteinuria in rats. Kidney Int,1992,41(1):115-123
19. Wada N, Ueda Y, Iidaka K, et al. Portions of basement membrane with decreased negative charge in various glomerulonephritis. Clin Nephrol,1990,34(1):9-16
20. Van Bruggen MC, Walgreen B, Rijke TP, et al. Antigen specificity of anti-nuclear antibodies complexed to nucleosomes determines glomerular basement membrane binding in vivo. Eur J Immunol, 1997,27(6):1564-1569
21. Van Bruggen MC, Walgreen B, Rijke TP, et al. Heparin and heparinoids present the binding of immune complexes containing nucleosomal antigens to the GBM and delay nephritis in MRL/lpr mice. Kidney Int,1996,50(5):1555-1564
22. Moseley R, Waddington R, Evans P, et al. The chemical modification of glycosaminoglycan structure by oxygen-derived species in vitro.Biochim Biophys Acta,1995,1244(2-3):245-252
23. Chen ZY, Jiang XY, Fei L. Effect of heparin on the anionic sites of glomerular basement membrane in adriamycin nephrosis in rats. Chin Med J,1992,105(8):671-675
24. Vlodavsky I, Eldor A, Haimovitz-Friedman A, et al. Expression of heparanse by platelets and circulating cells of the immune system: possible involvement in diapedesis extravasation. Invasion Metastasis 1992,12(2):112-127
25. Goode NP, Shires M, Crellin DM, et al. Alteration of GBM charge and structure in diabetic nephropathy. Diabetologia 1995,38(12):1455-1465
26. Van Det NF, van den Born J, Tamsma JT, et al. Effects of high glucose on the production of HSPG by mesangial and epithelial cells. Kidney Int,1996,49(4):1079-1089
27. Ha TS, Song CJ, Lee JH. Effect of advanced glycosylation endproducts on perlecan core protein of glomerular epithelium.Pediatr Nephrol,2004,19(11):1219-1224
28. Myrup B, Hansen PM, Jensen T, et al. Effect of low-dose heparin on urinary albumin excretion in insulin-dependent diatetes mellitus. Lancet, 1995,345(8947):421-422
29. Van den Born J, van den Heuvel LP, Bakker MA, et al.Distribution of GBM HSPG core protein and side chains in human glomerular disease.Kidney Int, 1993,43(2):454-463
30. Birmele B, Thibault G, Nivet H, et al. In vitro decrease of glomerular heparan sulfate by lymphocytes form idiopathic nephritic syndrome. Kidney Int, 2001,59(3):913-922
31. Birmele B, De Agostini A, Girardin EP. Increased glomerular cell heparan sulfates in vitro by ciclosporin A: a Possible explanation of Its beneficial effect in idiopathic nephrotic syndrome. Nephron. 2001,88(2):156-162
32. Holt RC,Webb NJ,Ralph S,et al. Heparanase activity is dysregulated in children with steroid-sensitive nephrotic syndrome. Kidney Int, 2005. 67(1):122-129
33. Levidiotis V,Kanellis J, Ierino FL, et al. Increased expression of heparanase in puromycin aminonucleoside nephrosis. Kidney Int, 2001,60(4):1287-1296
34. Zcharia E, Metzger S, Chajek-Shaul T, et al. Transgenic expression of mammalian heparanase uncovers physiological function of heparin sulfate in tissue morphogenesis, vascularization, and feeding behavior. FASEB J,2004,18(2):253-263
35. Van den Heuvel LP, Westenend PJ, van den Born J, et al. Aberrant proteoglycan composition of the GBM in a patient with Denys-Drash syndrome. Nephrol Dial Transplant,1995,10(12):2205-2211
36. Ljungberg P, Rapola J, Holmberg C, et al. Glomerular anionic charge in congenital nephrotic syndrome of the Finnish type. Histochem J,1995,27(7):536-546
37. Wang L, Brown JR, Varki A, et al. Heparin’s anti-inflammatory effects require glucosamine 6-O-sulfation and are mediated by blockade of L- and P-selectins. J Clin Invest, 2002,110(1):127-136
38. Wan MX, Zhang XW, Torkvist L, et al. Low molecular weight heparin inhibit tumor necrosis facoter alpha-induced leukocyte rolling. Inflamm Res, 2001,50(12):581-584
39. Parish CR, Freeman C, Hulett MD. Heparanase: a key enzyme involved in cell invasion. Biochim Biophys Acta,2001,1471(3):M99-108
40. Matsuda M, Shikata K, Shimizu F, et al. Therapeutic effect of sulfated hyaluronic acid, a potential selectin- blocking agent, on experimental progressive mesangial proliferative glomerulonephritis. J Pathol, 2002,198(3):407-414
肾小球滤过屏障由多孔的内皮细胞、基底膜（GBM）、足细胞及其足突之间的裂孔隔膜构成。GBM作为滤过屏障的重要组成部分，由多种细胞外基质（ECM）包括Ⅳ型胶原（collagenⅣ）、层粘连蛋白（Laminin）及硫酸类肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteoglycans，HSPGs）交互作用形成独特的分子筛结构，能够从分子大小和电荷选择性上限制肾小球的滤过功能。足细胞和内皮细胞表面分布着HSPGs，它不仅可与GBM成分相互作用，起着“分子锚”的作用；还可与多种有着重要生物学功能的生长因子包括EGF（表皮生长因子）、FGF（成纤维细胞生长因子）等相作用而参与肾小球内的炎症反应。HSPGs表达分布的改变影响着肾小球滤过功能。近年来围绕HSPGs与蛋白尿的发生机制研究越来越多，本文就此做一综述。
1. 肾小球中HSPGs的分布与功能
肾小球中富含多种不同的HSPGs成分，并分别在肾小球内不同部位呈现不同程度的表达分布。HSPGs共同的分子结构特征为核心蛋白及与之相连的葡聚糖胺侧链，在成熟的GBM中主要由硫酸类肝素（HS）侧链与核心蛋白结合，而硫酸软骨素、硫酸角质素、硫酸皮肤素或透明质酸糖胺等较罕见[1]。HSPGs分子间存在复杂的交联作用，有着不同的蛋白水解酶特性，其HS侧链的分子大小和空间结构的异质性而使电泳特性多变，因而确定GBM中HSPGs分子构成相当困难[1]。目前已知的参与GBM构成的HSPGs包括基底膜蛋白多糖（perlecan）、集聚蛋白（agrin）、ⅩⅧ 型胶原（collagenⅩⅧ）；而肾小球固有细胞（包括足细胞、内皮细胞、系膜细胞）表面表达分布的HSPGs包括syndecan、glypican、betaglycan、CD44。
1.1. Perlecan 是最早发现的基膜成分中的HSPGs，并因其在电镜下串珠样影像而得名。Perlecan在机体的许多脏器中的内皮基膜中广泛表达，参与着炎症反应、血管生成、血栓形成等多种病理生理过程。在肾脏发育的囊胚期即可发现GBM上perlecan的表达，在发育成熟的肾脏中perlecan主要在系膜区、袍曼氏囊和肾小管的基膜表达，免疫电镜显示perlecan在GBM近内皮细胞侧局限分布[2]。Perlecan由HSPG2基因编码，定位与1号染色体短臂（1p35~p36.1）。它的核心蛋白（467kD）由5个结构域组成，位于N 端的结构域Ⅰ含有3个相邻的类肝素葡聚糖胺侧链结合位，位于C端的结构域Ⅴ也可由1个同样的结合位，偶尔也可发现结构域Ⅳ上结合硫酸软骨素多糖侧链[3,4]。Perlecan分子中特异的HS侧链结构域对其生物学功能的发挥至为关键。
Perlecan的HS侧链携带的负电荷对肾小球滤过屏障功能中电荷选择性滤过具有重要意义。在实验动物模型小鼠（HSPG2△3/△3）中发现，当其perlecan分子结构域Ⅰ中HS侧链先天缺陷时，小鼠肾脏GBM上硫酸软骨素蛋白多糖表达增加，生理状态下无异常蛋白尿发生，但予高蛋白负荷时即发生蛋白尿[5]。Perlecan依赖其HS侧链与其它GBM成分laminin、 collagenⅣ、entactin/nidogen、 fibulin结合[6]；与ECM成分纤维连接蛋白（fibronectin）结合[7]；依赖其C端结构域与GBM中另一类HSPG组分collagenⅩⅧ 结合[8]；依赖其分子中多个lamininG结构域与足细胞基底侧蛋白α-dysroglycan结合[9]；内皮细胞表面表达的perlecan参与FGF-2与其受体结合而介导内皮细胞有丝分裂信号[10]；因而perlecan在肾小球滤过屏障中多种细胞和基质成分的交互作用的网络中起着重要的调节作用。
1.2. Agrin 是近年来逐渐被认识的GBM富含的HSPGs成分之一。Agrin在神经肌接头部位的表达研究十分深入，它控制神经细胞突触的形成及功能发挥，参与血脑屏障发育过程并影响其通透功能[11]。同时也发现agrin在全身微血管部位的表达；在肾脏中GBM表达最丰富，而肾小管、袍曼氏囊及小血管部位极少表达，免疫电镜显示agrin在GBM全层均质的沉积[2,12]。Agrin由AGRN基因编码，紧邻perlecan编码基因定位于1p36.1-1pter，其基因序列上有x、y、z三个剪切位点，在不同的组织中可发现不同片段大小的同源异形体 [13]。
Agrin依赖其分子N端有laminin结合区(laminin-binding domain)与laminin结合而锚定于GBM，并通过分子中心部位2个HS侧链决定影响着GBM的电荷分布[6]。Agrin在肾小球滤过屏障中足细胞和内皮细胞的细胞表面与GBM交界面，参与着细胞对基质的黏附。Agrin通过分子C端的3个类laminin结构域（laminin-like domain）可与足细胞基底侧dysroglycanα/β复合体中α亚单位结合，并通过dysroglycan与肌营养不良蛋白-糖蛋白的复合体（dystropin-associatecd glycoprotein complex，DGC）而与足细胞骨架F-actin相连结[14]。Agrin的类laminin结构域可与足细胞基底侧整合素integrin αⅤβ1 结合，通过整合素介导细胞骨架α-actin及F-actin与GBM的结合[15]。此外，agrin分子中N端结构域与laminin的结合，并由laminin介导与足细胞表面dysroglycan及integrin αⅤβ1复合体的结合，同样地使足细胞细胞骨架与GBM成分形成紧密的结合体[6]。Agrin参与的上述足细胞及足突对GBM的紧密吸附对肾小球在高灌注压下维持其有效的滤过功能十分重要。
Agrin在基因编码修饰过程中产生的y插入位点的四肽决定簇决定着它与肝素的结合力，而与肝素的这种结合可抑制agrin与α-dysroglycan的结合[16]。但目前对肾脏表达的agrin是否具有这种特异的y插入片段尚有争议[12]。
1.3. CollagenⅩⅧ 在肾脏系膜区表达更多于在GBM的表达。collagenⅩⅧ分子N端有3个HS侧链结合区域；在基因编码修饰过程中可出现长或短的N端片段产物，而在肾脏主要表达短N端片段产物；其C端剪切后产物即为内皮他汀（endostatin），在GBM与perlecan共定位表达，能够抑制内皮细胞增生和迁移[17]。
1.4. Syndecans 家族作为跨膜分布的HSPGs，其共同的结构特征位胞外区（含HS侧链结合位点）、跨膜疏水区及短胞浆区。在肾脏只发现了syndecan-1及syndecan-4的表达，syndecan-1分布在足细胞基底侧，syndecan-4主要分布在肾小球内皮细胞，并特异地介导内皮细胞与ECM的黏附及迁移，在内皮细胞损伤及炎症反应中起着重要功能[18,19]。
1.5. Glypicans在胚胎发育的不同阶段、不同的脏器组织呈现不同的表达分布而参与着形态学发育过程，在肾脏发育过程中发现了glypican-1、glypican-3、glypican-4、glypican-5的表达[20]。目前对其在功能的研究尚不深入。
1.6. Betaglycan是TGFβ的Ⅲ型受体，在皮质肾间质、微血管内皮细胞及足细胞表达。Betaglycan分子中HS侧链及硫酸软骨素侧链并不影响与TGFβ的结合。Betaglycan以受体依赖方式调节TGFβ在炎症反应及间质纤维化过程中的生物学效应[21]。
1.7. CD44分布在内皮细胞及系膜细胞表面。在编码翻译过程中存在多种同源异形体，并可具有HS侧链或硫酸软骨素侧链。CD44作为一种细胞表面透明质酸受体，参与炎症趋化过程[22]。
2. 肾小球中HSPGs与蛋白尿
蛋白尿是肾小球疾病最常见的表现，而蛋白尿本身就是慢性肾脏疾病进展的一项持久的独立危险因素。肾小球滤过屏障的异常与蛋白尿发生密切相关，肾小球中HSPGs结构和功能的改变在蛋白尿发生和进展中起着关键作用。
2.1. HSPGs的HS侧链对肾小球选择性滤过功能的影响
许多研究证实了GBM上HSPGs的HS侧链决定着肾小球电荷选择性滤过功能。动物实验中发现应用肝素酶水解HS侧链后GBM对白蛋白和铁蛋白滤过增加[23]；给实验大鼠注射特异的HS侧链的单克隆抗体可发生急性的一过性的蛋白尿[24]；在以蛋白尿为特征的肾小球疾病如微小病变、膜性肾病、糖尿病肾病，阿霉素肾病大鼠模型及海曼肾炎大鼠模型中，应用阳离子探针给PEI（多聚氮丙啶）染色方法证实GBM部位HS相关的负电荷位点减低，且白蛋白漏出率与GBM上HS染色强度相关[25]。此外HS侧链作为GBM中不同HSPGs成分之间的交联作用位点，对维持GBM的稳定十分重要，因而同时维持了肾小球机械屏障功能。
HSPGs的HS侧链参与蛋白尿发生的机制推测可能与以下三方面有关：⑴免疫复合物对HS侧链的遮蔽作用。在狼疮性肾炎中，体内体外实验均证实了自身免疫产生的抗核小体抗体可与GBM上HS侧链结合形成复合体，尽管HS侧链表达量未改变，但受自身抗体复合物的遮蔽作用而不能发挥负电荷屏障功能，产生蛋白尿 [26]。应用肝素治疗可减少免疫复合物的局部沉积，改善HS侧链在GBM分布的减低，降低蛋白尿[27]。⑵炎症反应及自由基作用下HSPGs分子的解聚。阿霉素诱导肾病大鼠模型和嘌呤霉素诱导肾病大鼠模型中药物诱导产生的自氧由基（•OH），海曼肾炎模型中补体激活途径中产生的氧自由基，缺血损伤模型黄嘌呤氧化酶产生的氧自由基均可对蛋白多糖分子中HS侧链产生解聚作用，从而改变了电荷分布[28]。在阿霉素诱导肾病大鼠模型、STZ诱导糖尿病大鼠模型及SLE大鼠模型中应用肝素可起到抗氧化剂作用，改善电荷屏障的损害并减轻蛋白尿[29]。此外由于HS侧链解聚后，先前与HS侧链连结的相关蛋白分子如FGF、PDGF等从GBM中“静止态”被释放，与肾小球固有细胞或循环中炎症细胞作用而参与了炎症反应过程。⑶蛋白水解酶的分解作用。炎症反应中中性粒细胞和活化的血小板均可释放丝氨酸水解酶、组织蛋白酶及肝素酶而分解HS侧链与核心蛋白的结合，而产生蛋白尿[30]。
2.2. 不同病理改变的肾小球疾病中HSPGs的表达变化
2.2.1. 糖尿病肾病（DM） 目前有关HSPGs与DN蛋白尿发生关系的研究较为深入。在DN的GBM增宽同时伴有HS染色减低，硫酸化程度减低，且与蛋白尿程度相关[31]。体外培养的足细胞或系膜细胞在高糖培养条件或糖基化产物作用下，均可发现perlecan及agrin核心蛋白合成减少[32，33]。临床上应用肝素治疗可改善GBM的增宽和负电荷位点的减少，并减轻蛋白尿[34]。
2.2.2. 微小病变（MCD）儿童原发性肾病综合征中85%为MCD，以电镜下足突广泛融合及大量蛋白尿为特征。MCD肾组织中也发现GBM负电荷染色的减低，但免疫组化技术下HS染色减低同时并未发现agrin核心蛋白沉积减少[35]。将MCD患者外周血淋巴细胞、单个核细胞与大鼠足细胞及系膜细胞体外共培养，发现特别是外周血单个核细胞分泌的上清成分能够抑制HS侧链合成，但在复发组和缓解组中无差异；在IgA肾病、膜性肾病患者中则未发生如此改变[36]。环孢霉素A可改善MCD患儿血液成分诱导的HS合成障碍,[37]。
另有部分研究者对肝素酶对HSPGs水解作用在蛋白尿中的机制展开了研究。在儿童激素敏感型MCD患者中，发现其外周血单个核细胞的肝素酶表达减低，且复发组显著低于缓解组；而尿液中肝素酶明显增高，且复发组显著高于缓解组；而在成人激素敏感型MCD患者中外周血单个核细胞的肝素酶表达减低，尿液中肝素酶明显减低，但复发组与缓解组无差异 [38]。在儿童激素敏感型MCD中血液和尿液中肝素酶的不平衡现象，提示着可能存在肾脏原位产生的肝素酶，或者可能在肾脏局部还有其它因素影响着肝素酶活性的发挥。嘌呤霉素肾病大鼠模型中即发现在足细胞上肝素酶的表达与蛋白尿的相关性[39]。在高表达肝素酶的转基因大鼠中也发现了肝素酶局部表达增高与蛋白尿的相关[40]。因而，肾脏局部产生或释放的肝素酶可能作为一种致病性体“通透因子”，通过HS侧链的降解而改变电荷屏障，参与了MCD中蛋白尿的发生。
2.3. Denys-Drash 综合征（DDS）是一种由于WT-1基因杂合子突变造成的遗传性疾病，表现为Wilms’瘤伴发严重的肾病综合征及性腺发育障碍。在弥漫硬化的肾小球中GBM的HS含量减低，而硫酸软骨素含量增加，其agrin核心蛋白表达并未改变[41]。但目前WT-1表达障碍与HSPGs表达的关系尚不清楚。
2.4. 先天性肾病综合征（芬兰型，CNS-F）是一种由于NPHS1基因编码的裂孔隔膜蛋白nephrin表达异常造成的遗传性肾病，表现为婴幼儿期严重的肾病综合征。在足突广泛融合的同时，伴有GBM上HS含量减低，而硫酸软骨素含量增加[42]。但目前nephrin表达障碍与HSPGs表达的关系尚不清楚。
2.5. 肾小球肾炎（glomerulonephritis）HSPGs参与了炎症反应过程中的各个环节，包括白细胞和内皮细胞的激活、滚动迁移、黏附，白细胞从血管中的渗出等过程。同时炎症反应中内皮细胞和白细胞产生释放的肝素酶活性也明显增高，使多种HS侧链结合的生物活性物质释放而参与了炎症反应。在不同的增生性肾小球炎症中均可发现肾小球局部HS侧链染色减低，agrin表达减低，而细胞表面CD44表达增高[43]。因而，不少研究者在研究HSPGs在肾脏局部的抗炎机制同时，更关注肝素制剂在肾小球疾病中的治疗效应。肝素除了抗凝作用还可在肾脏发挥独立的抗炎效应：肝素可依赖分子中C6位的硫酸基阻断选择素P/L诱导的细胞黏附[44]，低分子肝素可抑制TNF-α介导的白细胞滚动、黏附及组织浸润等过程[45]；肝素可抑制中性粒细胞、淋巴细胞及、内皮细胞及血小板释放肝素酶的活性[46]。有研究者在慢性进展肾炎动物模型中应用硫酸化的透明质酸，发现选择素P依赖的白细胞在肾小球的浸润受到抑制，蛋白尿减轻[47]。因而，对HSPGs在慢性肾脏炎症中病理机制的研究，为慢性肾脏疾病治疗开辟了新的思路。
参考文献
1. Miner JH. Renal basement membrane components[J]. Kidney Int.1999,56(6):2016-2024
2. Groffen AJ, Ruegg MA, Dijkman H, et al. Agrin is a major heparan sulfate proteoglycan in the human glomerular basement membrane [J]. J Histochem Cytochem, 1998, 46(1) 19-27
3. Cohen IR, Grassel S, Murdoch AD, et al. Structural characterization of the complete human perlecan gene and its promoter [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1993, 90(21):10404-10408
4. Murdoch AD, Dodge GR, Cohen I, et al. Primary structure of the human HSPG from basement membrane (HSPG2/perlecan).A chimeric molecule with multiple domains homologous to the low density lipoprotein receptor, laminin, neural cell adhesion molecules, and epidermal growth factor[J]. J Biol Chem,1992,267(12):8544-8557
5. Morita H, Yoshimura A, Inui K, et al. Heparan sulfate of perlecan is involved in glomerular filtration[J]. J Am Soc Nephrol,2005,16(6):1703-1710
6. Tsen G, Halfter W, Kroger S, et al.. Agrin is a heparan sulfate proteoglycan [J]. J Biol Chem. 1995,270 (7):3392-3399
7. Heremans A, De Cock B, Cassiman JJ, et al. The core protein of the matrix-associated heparin sulfate proteoglycan binds to fibronectin[J]. J Biol Chem,1990,265(15):8716-8724
8. Mongiat M, Sweeney SM, San Antonio JD, et al. Endorepellin, a novel inhibitor of angiogenesis derived from the C terminus of perlecan[J]. J Biol Chem,2003,278(6):4238-4249
9. Brown JC, Sasaki T, Gohring W, et al. The C-terminal domain V of perlecan promotes beta1 integrin-mediated cell adhesion, binds heparin, nidogen and fibulin-2 and can be modified by glycosaminoglycans[J]. Eur J Biochem, 1997, 250(1):39-46
10. Guillonneau X, Tassin J, Berrou E, et al. In vitro changes in plasma membrane heparan sulfate proteoglycans and in perlecan expression participate in the regulation of fibroblast growth factor 2 mitogenic activity [J]. J Cell Physiol, 1996,166(1):170-187
11. Denzer AJ, Gesemann M, Ruegg MA, et al. Diverse functions of the extracellular matrix molecule agrin[J]. Sem in Neurosci, 1996,8(6): 357-366
12. Groffen AJ, Buskens CA, van Kuppevelt TH, et al. Primary structure and high expression of human agrin in basement membrane of adult lung and kindey. Eur J Biochem, 1998,254(1):123-128
13. Rupp F, Ozcelik T, Linial M, et al. Structure and chromosomal localization of the mammalian agrin gene[J]. J Neurosci, 1992, 12(9):3535-3544
14. Gesemann M, Brancaccio A, Schumacher B, et al. Agrin is a high-affinity binding protein of dystroglycan in non-muscle tissue[J]. J Biol Chem, 1998,273(1):600-605
15. Martin PT, Sanes JR. Integrins mediate adhesion to agrin and modulate agrin signaling[J]. Development, 1997,124(19):3909-3917
16. O’Toole JJ, Deyst KA, Bowe MA, et al. Alternative splicing of agrin regulates its binding to heparin α-dysroglycan, and the cell surface. Proc Natl Sci USA, 1996;93(14):7369-7374
17. Rosenzweig LJ, Kanwar YS. Removal of sulfated (heparin sulfate) or nonsulfated(hyaluronic acid) glycosaminoglycans results in increased permeability of the glomerular basement membrane to 125-I-bovine serum albumin.Lab Invest,1982,47(2):177-184
18. Van den Born J, van den Heuvel LP, Bakker MA, et al. A monoclonal antibody against GBM heparan sulfate induces an acute selective proteinuria in rats. Kidney Int,1992,41(1):115-123
19. Wada N, Ueda Y, Iidaka K, et al. Portions of basement membrane with decreased negative charge in various glomerulonephritis. Clin Nephrol,1990,34(1):9-16
20. Van Bruggen MC, Walgreen B, Rijke TP, et al. Antigen specificity of anti-nuclear antibodies complexed to nucleosomes determines glomerular basement membrane binding in vivo. Eur J Immunol, 1997,27(6):1564-1569
21. Van Bruggen MC, Walgreen B, Rijke TP, et al. Heparin and heparinoids present the binding of immune complexes containing nucleosomal antigens to the GBM and delay nephritis in MRL/lpr mice. Kidney Int,1996,50(5):1555-1564
22. Moseley R, Waddington R, Evans P, et al. The chemical modification of glycosaminoglycan structure by oxygen-derived species in vitro.Biochim Biophys Acta,1995,1244(2-3):245-252
23. Chen ZY, Jiang XY, Fei L. Effect of heparin on the anionic sites of glomerular basement membrane in adriamycin nephrosis in rats. Chin Med J,1992,105(8):671-675
24. Vlodavsky I, Eldor A, Haimovitz-Friedman A, et al. Expression of heparanse by platelets and circulating cells of the immune system: possible involvement in diapedesis extravasation. Invasion Metastasis 1992,12(2):112-127
25. Goode NP, Shires M, Crellin DM, et al. Alteration of GBM charge and structure in diabetic nephropathy. Diabetologia 1995,38(12):1455-1465
26. Van Det NF, van den Born J, Tamsma JT, et al. Effects of high glucose on the production of HSPG by mesangial and epithelial cells. Kidney Int,1996,49(4):1079-1089
27. Ha TS, Song CJ, Lee JH. Effect of advanced glycosylation endproducts on perlecan core protein of glomerular epithelium.Pediatr Nephrol,2004,19(11):1219-1224
28. Myrup B, Hansen PM, Jensen T, et al. Effect of low-dose heparin on urinary albumin excretion in insulin-dependent diatetes mellitus. Lancet, 1995,345(8947):421-422
29. Van den Born J, van den Heuvel LP, Bakker MA, et al.Distribution of GBM HSPG core protein and side chains in human glomerular disease.Kidney Int, 1993,43(2):454-463
30. Birmele B, Thibault G, Nivet H, et al. In vitro decrease of glomerular heparan sulfate by lymphocytes form idiopathic nephritic syndrome. Kidney Int, 2001,59(3):913-922
31. Birmele B, De Agostini A, Girardin EP. Increased glomerular cell heparan sulfates in vitro by ciclosporin A: a Possible explanation of Its beneficial effect in idiopathic nephrotic syndrome. Nephron. 2001,88(2):156-162
32. Holt RC,Webb NJ,Ralph S,et al. Heparanase activity is dysregulated in children with steroid-sensitive nephrotic syndrome. Kidney Int, 2005. 67(1):122-129
33. Levidiotis V,Kanellis J, Ierino FL, et al. Increased expression of heparanase in puromycin aminonucleoside nephrosis. Kidney Int, 2001,60(4):1287-1296
34. Zcharia E, Metzger S, Chajek-Shaul T, et al. Transgenic expression of mammalian heparanase uncovers physiological function of heparin sulfate in tissue morphogenesis, vascularization, and feeding behavior. FASEB J,2004,18(2):253-263
35. Van den Heuvel LP, Westenend PJ, van den Born J, et al. Aberrant proteoglycan composition of the GBM in a patient with Denys-Drash syndrome. Nephrol Dial Transplant,1995,10(12):2205-2211
36. Ljungberg P, Rapola J, Holmberg C, et al. Glomerular anionic charge in congenital nephrotic syndrome of the Finnish type. Histochem J,1995,27(7):536-546
37. Wang L, Brown JR, Varki A, et al. Heparin’s anti-inflammatory effects require glucosamine 6-O-sulfation and are mediated by blockade of L- and P-selectins. J Clin Invest, 2002,110(1):127-136
38. Wan MX, Zhang XW, Torkvist L, et al. Low molecular weight heparin inhibit tumor necrosis facoter alpha-induced leukocyte rolling. Inflamm Res, 2001,50(12):581-584
39. Parish CR, Freeman C, Hulett MD. Heparanase: a key enzyme involved in cell invasion. Biochim Biophys Acta,2001,1471(3):M99-108
40. Matsuda M, Shikata K, Shimizu F, et al. Therapeutic effect of sulfated hyaluronic acid, a potential selectin- blocking agent, on experimental progressive mesangial proliferative glomerulonephritis. J Pathol, 2002,198(3):407-414
最后编辑于 2006-12-25 · 浏览 2363
1 4 点赞
