【整理】免疫组织化学标本的制备-固定

免疫组织化学标本的制备-固定
（一） 固定的目的和作用
固定的目的在于迅速终止酶的活性，避免组织细胞结构的解体，阻止细胞内外肽类和蛋白质的扩散移位，增强组织细胞对标本制作过程中各种有害影响的对抗作用，总之，在于达到固定抗原和保存组织细胞形态结构的目的。尤其是保持抗原分子上有限数目氨基酸顺序和抗原决定簇的完整性，保持抗原分子三维空间构型的稳定性以便于结合特异性抗体。尤其是大多数神经激素和肽类物质，因为具有水溶性，在进行免疫组织化学研究之前，常常需要固定处理。但是肽类物质和蛋白质的物理化学性质不同，因而对不同的固定剂或者固定方法的适应程度也不尽相同。某些固定剂甚至可以同时破坏和/或保护同一抗原物质的不同抗原决定簇。因此，在进行免疫组织化学研究的时候，先要了解所研究物质（如蛋白质和肽类）的化学性质，再根据需要来选用适宜的固定剂或固定方法，改进固定的条件。
目前，免疫组织化学研究中常用的固定剂仍然是醛类固定剂，其中又以多聚甲醛和戊二醛最为常用。多聚甲醛和戊二醛都是交联固定剂，既能更好的保存组织细胞的形态结构，又能使蛋白质得以固定。尤其是戊二醛，因为其有两个醛基，交联连接的能力更强。对于小分子的抗原，如肽类激素，只有用交联固定剂才能得到良好的固定并且是抗原得到较好的保存。然而，醛固定剂也有缺点，即由于广泛形成的交联连接，可以造成某些抗原被掩盖，甚至导致抗原变性，特别是对大的蛋白质抗原。这样的缺点在戊二醛表现得更加突出，所以在光镜标本中一般不使用戊二醛，只是在电镜标本中为了利用戊二醛两好的保存组织细胞超微结构的优点，而在多聚甲醛固定液中加入适量的戊二醛。在光镜标本的固定中，也常常使用Bouin固定液，它能迅速穿透组织，使固定充分，又不引起组织收缩，其中的***可以沉淀蛋白质。
（二） 固定的方法
组织固定的方法一般采用心内灌流固定法，尤其是神经组织的固定更是如此。动物（如大鼠）经过腹腔注射戊巴比妥钠等麻醉或者乙醚吸入麻醉后，开胸暴露心脏，用眼科剪剪开心尖，将灌流针头经左心室插入主动脉，先快速灌入100ml生理盐水(含有0.01%肝素，光镜，大鼠)，或者100ml0.01%肝素-2.5%PVP-0.9%NaCl-0.5-盐酸普鲁卡因冲洗液（电镜，大鼠），此冲洗过程必须在2min钟内完成，接着滴注400ml4摄氏度灌流固定液。灌流瓶内的液面应距离动物心脏约高出1m以使灌流压略高于动物收缩压。灌流固定液时先快速冲灌1min，然后调慢灌流速度以在1h内完成。灌流后将动物置于撒有少量同样固定液的塑料袋中，放入4摄氏度冰箱内1h，取出拟检组织如同样固定液内后固定2~4小时。然后，若拟作石蜡切片，组织在后固定后经生理盐水洗涤后进行脱水等后续处理，若拟做恒冷箱切片或者振荡切片，组织在后固定后入20%~30%蔗糖溶液过夜以防冰晶形成，次日切片。通常，制备光镜标本，动物灌流固定时，不用灌流筒滴注，而可以用注射器慢速推注。在小鼠，因为主动脉的口径小，灌流针不易插入，所以可以将灌流针自心尖插入左心室，用止血钳连同心脏一道夹牢灌流针后，进行灌流固定。