细胞免疫荧光检测实验详细步骤

一、实验准备：

1、材料 细胞爬片、细胞固定液（如4%多聚甲醛）、PBS缓冲液、通透剂Triton X-100、正常山羊血清或牛血清白蛋白（BSA）、一抗、二抗（荧光标记）、DAPI染液、防荧光淬灭封片剂、载玻片、盖玻片、湿盒。

2.仪器：

①荧光显微镜：核心装备！需要匹配你二抗荧光染料的特定激发/发射滤光片组。

②离心机：必要时离心抗体。

③移液器 & 枪头：精确移液必备。

④培养箱 (37°C, 5% CO2)：细胞培养和一抗37°C孵育用。

⑤冰箱 (4°C & -20°C)：储存试剂和抗体。

⑥摇床/震荡器 (可选)：PBS冲洗更均匀高效。

⑦镊子、吸水纸/滤纸：操作盖玻片和吸干多余液体。

二、实验步骤

[lbk]一R[rbk]细胞培养与爬片 将细胞接种于放置有盖玻片的培养皿或孔板中，在适宜条件下培养至细胞生长状态良好且达到合适的融合度。

[lbk]二R[rbk]细胞固定 小心吸去培养液，用PBS轻轻冲洗细胞2-3次，每次3-5分钟。加入适量4%多聚甲醛，室温固定15-20分钟。

[lbk]三R[rbk]通透处理 固定完成后，PBS冲洗3次，每次5分钟。加入含0.1%-0.3%Triton X-100的PBS，室温孵育10-15分钟，增加细胞膜通透性。

[lbk]四R[rbk]封闭 PBS冲洗后，用含5%-10%正常山羊血清或3%-5%BSA的PBS溶液，室温封闭30-60分钟，减少非特异性结合。

[lbk]五R[rbk]一抗孵育 吸去封闭液，根据说明书加入适量稀释好的一抗，将盖玻片放入湿盒，4℃孵育过夜或37℃孵育1-2小时。

[lbk]六R[rbk]二抗孵育 取出盖玻片，PBS冲洗3次，每次5-10分钟。加入荧光标记的二抗，室温避光孵育30-60分钟。

[lbk]七R[rbk]细胞核染色 PBS冲洗后，滴加DAPI染液，室温避光孵育5-10分钟，对细胞核进行染色。 封片 PBS快速冲洗后，将盖玻片细胞面朝下置于滴有防荧光淬灭封片剂的载玻片上，尽量避免气泡产生。

[lbk]八R[rbk]观察与拍照 将封好的玻片置于荧光显微镜下，根据荧光标记的波长选择合适的激发光和发射光通道进行观察，并拍照记录。