手把手教你做--分子克隆之无缝克隆-In-Fusion Cloning

背景知识介绍

无缝克隆（Seamless Cloning）可以同时将 1 到多个片段高效插入到任意载体。目前广泛应用的无缝克隆主要是 Gibson Assembly 和 In-Fusion Cloning。无缝克隆的核心是设计含有同源序列的引物和利用同源重组原理组装。本次protocol主要介绍In-Fusion Cloning。

实验步骤

1. 同源序列引物设计

在正、反向PCR 引物5'端引入15~25bp同源序列，使得扩增产物之间以及扩增产物与线性化载体之间各有一段同源序列。比如以TP53-CDS为例设计同源序列引物，并连接到pDNA3.1-flag（Addgene # #210342）载体上。

1.1. 进入Genome browser 下载TP53-CDS序列（见红色箭头指引）

进入Genome browser，输入TP53，选择MANE select的序列

进入下一个界面后，按箭头所示，选择MANE select序列：

进入下一个界面后，选择Genomic sequence：

再进入下一个页面后，点选CDS，然后点击提交，最后复制TP53-CDS序列到SnapGene软件中

1.2.在SnapGene设计引物：

引物设计遵循一般引物设计的原则：GC含量40-60%，Tm~60-65°C，长度约15-30bp等。

首先在pDNA3.1-flag中，找到合适的插入位点构建重组载体，因为载体带有flag标签，因此，可以自己目的，在TP53-CDS的N端或者C端连接flag。本例以N端连接flag标签为例：

1.2.1.在pDNA3.1-flag载体中插入TP53-CDS片段，构建重组载体：

插入TP53-CDS片段:

1.2.2设计正反向引物用来cDNA上p下来TP53-CDS片段：

正向引物：5’-gattataaagatgatgatgataaaATGGAGGAGCCGCAGTCAGATCCTA

反向引物：5‘- agatgcatgctcgagtcaTCAGTCTGAGTCAGGCCCTTCTGTCTTG

1.2.3.设计pDNA3.1-flag载体正反向引物，用来线性化p载体片段：

正向引物：5‘- tgactcgagcatgcatctagagggcc

反向引物：5‘- ttatcatcatcatctttataatccatggtggcggcg

2.分别用上述两对引物进行PCR反应，分别回收两个PCR片段，见下图箭头所示：

3.回收PCR片段后，即可进行In-Fusion克隆连接：

因TP53-CDS片段和pDNA3.1-flag片段分别有同源序列（见黑色方框），即可通过同源重组原理进行重组：

参考反应体系：

以10 μL重组体系计算，载体所需DNA 量为：载体碱基数除以100(ng), 片段所需DNA 量为：片段碱基数除以50(ng)。比如若线性化载体长度为10kb, 浓度为100ng/μL, 片段长度为2 kb, 浓度为40ng/μL。各片段摩尔比为1:1。则重组体系如下表：

重组反应：50 ℃反应30~45 min。需在PCR仪或水浴锅等温控精确的仪器上进行反应。

4. 对重组产物进行转化、涂板，挑单克隆送Sanger 测序确认：

4.1. 在冰上解冻感受态细胞

4.2. 取5~10 μL重组产物，加入到50~100 μL感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，冰上孵育30 min。

4.3. 42℃热激45 s, 冰上孵育10~15 min。

4.4. 加入约500 μL无抗LB 培养基，37℃, 200 rpm, 震荡培养60 min。

4.5. 取适当体积菌液均匀涂布在相应抗生素的平板上，平板倒置于37℃培养箱过夜12~16h培养。

4.6. 挑取3~5个单克隆测序鉴定。

每日一言

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