麦角硫因激活NRF2/HO-1信号通路改善血管性痴呆大鼠认知功能障碍研究
血管性痴呆（VD）是老年性痴呆中常见的类型之一，具有发病率、死亡率高以及生活质量下降的特点，是导致痴呆的第二大原因。随着老龄化时代的到来，到2050年，痴呆患者或相关认知障碍患者的数量预计将增加到1.15亿［1-2］。早期预防和治疗能够有效地控制疾病的发展，改善患者认知障碍。
脑缺血性损伤被认为是VD的主要致病因素，但VD的发病机制尚未阐明［3］。目前认为VD可能由多种机制介导，包括氧化应激、细胞炎症因子和趋化因子水平异常改变以及线粒体功能障碍［4-6］。双侧颈动脉狭窄会伴随脑血流量的逐渐减少，一旦发生血管功能不全，将促进大量的活性氧（ROS）和炎症因子生成［7］，并导致局部形成炎症环境，抗氧化系统抑制，线粒体功能障碍和细胞损伤［8］，进而引起脑组织损伤，最终导致机体的认知功能受到影响。因此，靶向氧化应激和炎症反应可能是VD的一种有前途的治疗策略。
核因子E2相关因子2/血红素加氧酶1（NRF2/HO-1）信号通路在调节各种抗氧化防御和抗炎基因的表达中起着至关重要的作用［9］。研究表明，NRF2/HO-1信号通路在VD模型的动物中起到神经保护作用［10-11］。
麦角硫因是一种天然存在的甜菜碱氨基酸，同时具有硫醇和硫酮形式的互变异构体。体外研究表明，麦角硫因能够清除细胞内ROS，同时能去除细胞内羟基自由基和过氧亚硝酸盐等活性氮，调节细胞中炎症因子以及螯合二价金属阳离子（如铁和铜）水平。此外，麦角硫因还能防止紫外线辐射引起的细胞损伤以及具有保护细胞活性的作用［12］。在神经系统疾病中，麦角硫因也能发挥保护作用［13-14］。在阿尔茨海默病患者血液中，麦角硫因的浓度明显降低，并且与患者认知功能障碍的严重程度有关［15］。但麦角硫因是否通过调控NRF2/HO-1信号通路改善VD大鼠认知功能障碍研究较少。本研究建立VD大鼠模型，旨在探究麦角硫因对VD大鼠认知功能障碍的作用及具体分子机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 研究时间：2021年8月—2023年9月。
1.1.2 实验动物：实验选取SPF级雄性成年SD大鼠50只，均由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供［许可证号：SCXK（湘）2016-0002］，重量200~230 g，饲养于温度（22±2）℃、湿度（55±10）%、12 h明暗交替环境中，自由进食与饮水。本研究通过长沙市第一医院医学伦理委员会批准［伦理批号：（2023）伦会审【临研】第（66）号］。
1.1.3 实验试剂：麦角硫因（美国Sigma-Aldrich公司，货号：E7521）；NRF2抑制剂（ML385）（美国MedChemExpress公司，货号：HY-100523）；戊巴比妥钠（北京偶合科技有限公司，货号：OH004809）；硝普钠（美国Sigma-Aldrich公司，货号：PHR1423）；超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、白介素（IL）-1β试剂盒、IL-6试剂盒、肿瘤坏死因子（TNF）-α试剂盒（均由美国RbD公司提供，货号分别为DYC3419、MLB00C、MLB00C、MTA00B）；丙二醛（MDA）试剂盒（美国abcam公司，货号：ab238537）；谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒（上海酶联生物，货号：ml097316）；NRF2兔单克隆抗体、HO-1鼠单克隆抗体、醌氧化还原酶1（NQO1）山羊多克隆抗体（均由美国abcam公司提供，货号分别为ab62352、ab13248、ab2346）。
1.1.4 实验仪器：Morris水迷宫（上海玉研科学仪器有限公司，型号：YAN-MWMR），光学显微镜（日本OLYMPUS公司，型号：CKX53）和荧光显微镜（日本OLYMPUS公司，型号：CX31），酶联免疫检测仪（南京华东，型号：DG5033A）。
1.2 方法
1.2.1 动物分组：按随机数表法将实验大鼠分为对照组、模型组、麦角硫因组、麦角硫因+ML385组，每组12只。
1.2.2 动物模型建立：通过双侧颈总动脉永久性结扎法建立VD大鼠模型，模型组及药物处理组结扎双侧颈总动脉，对照组仅分离双侧颈总动脉及神经不进行结扎。使用45 mg/kg 3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，仰卧固定，常规消毒，颈部正中切口，分离双侧颈总动脉，腹腔注射2.5 mg/kg硝普钠溶液于模型组大鼠，随即夹闭双侧颈总动脉10 min，随后再通10 min，重复2次后缝合伤口，放回笼中待其苏醒，术后1周对各组大鼠进行Morris水迷宫试验训练1 d，以对照组大鼠平均逃避潜伏期的均值为参考值，计算手术后大鼠平均逃避潜伏期与参考值之差占对照组平均逃避潜伏期的比例，该值>20％定为痴呆鼠。
1.2.3 药物处理：麦角硫因组在造模前2周每天给予腹腔注射麦角硫因2 mg/kg，并在造模后继续给予2 mg/kg 麦角硫因2周，麦角硫因+ ML385组在造模前2周每天给予腹腔注射麦角硫因2 mg/kg以及ML385 30 mg/kg，造模后继续给予2 mg/kg 麦角硫因以及ML385 30 mg/kg 2周。
1.2.4 Morris水迷宫测试：Morris水迷宫测试分为2个部分。（1）定位航行实验：连续4 d训练大鼠4次，每次间隔时间需>30 min。每个试验随机选择4个池壁中的一个作为起点（每个起点只能选择1次），将大鼠放入水池中。记录系统记录大鼠找到平台的时间作为逃避潜伏期，若大鼠在120 s内找不到平台，则记为120 s，随后让大鼠在平台上休息30 s，再开始下次训练。（2）空间探索实验：第5天进行1次无平台试验，将大鼠置于第Ⅰ象限开始试验。将时间设定为120 s，并记录大鼠在第Ⅲ象限停留的时间，计算在第Ⅲ象限停留时间百分比。第1次测试在开始灌胃前，从而筛选出符合入组标准的大鼠。腹腔注射药物4周后再次测试，用于评价各组间的差异。
1.2.5 HE染色：石蜡包埋切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水。将切片放入苏木素水溶液中染色，酸水和氨水中分色，流水冲洗后入蒸馏片刻。70%和90%酒精中脱水，酒精伊红染色液染色2~3 min，染色后切片经纯酒精脱水，再经二甲苯透明，用中性胶密封切片并在光学显微镜下观察。
1.2.6 TUNEL染色：二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，用蛋白酶K修复组织后，在37 ℃下于每个样品中加入50 μL TUNEL染色液，孵育60 min。PBS洗涤3次，使用含有DAPI抗荧光猝灭溶液封片，使用荧光显微镜进行观察。
1.2.7 Western blotting法：取样、剪碎，使用冰浴进行匀浆处理，随后加入RIPA裂解液（含有蛋白酶抑制剂）帮助蛋白质释放并防止蛋白降解，获取组织总蛋白后用BCA法测定蛋白浓度，然后经过电泳、转膜、封闭、抗体孵育和压片显影检测海马组织中NRF2、HO-1和NQO1蛋白表达水平。
1.2.8 ELISA法：取出海马组织，用0.9%氯化钠溶液洗涤后放入匀浆管中。在试管中加入适量的预冷0.9%氯化钠溶液，匀浆组织，然后收集上清液。按照ELISA试剂盒操作说明检测海马组织中的氧化应激标志物SOD、MDA和GSH-Px，以及炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。
1.3 统计学分析
采用SPSS 22.0统计软件进行统计分析，符合正态分布的计量资料以（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 麦角硫因对VD大鼠认知功能障碍的影响
本研究成功建立了VD大鼠模型。模型组较对照组大鼠的逃避潜伏期延长，在目标象限停留时间百分比降低，差异有统计学意义（P<0.05）。麦角硫因组的逃避潜伏期较模型组缩短，目标象限停留时间百分比升高，差异有统计学意义（P<0.05）。麦角硫因+ML385组较麦角硫因组的逃避潜伏期延长，目标象限停留时间百分比降低，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.2 麦角硫因对VD大鼠海马组织病理变化的影响
HE染色结果表明：与对照组相比，模型组大鼠海马组织中神经元数量减少，细胞萎缩，形态异常，细胞核深度染色。通过麦角硫因的治疗，这种异常得到缓解。而与麦角硫因组相比，麦角硫因+ML385组海马组织损伤变严重，见图1。
2.3 麦角硫因对VD大鼠脑组织神经元凋亡的影响
与对照组相比，模型组大鼠脑组织神经元凋亡率增加，差异具有统计学意义（P<0.05）；与模型组相比，麦角硫因组大鼠脑组织神经元凋亡率降低，差异具有统计学差意义（P<0.05）；与麦角硫因组相比，麦角硫因+ML385组海马组织损伤严重，差异具有统计学意义（P<0.05）。
2.4 麦角硫因对VD大鼠海马组织NRF2、HO-1和NQO1蛋白表达水平的影响
与对照组相比，模型组大鼠海马组织NRF2、HO-1和NQO1蛋白表达水平降低，差异具有统计学意义（P<0.05）；与模型组相比，麦角硫因组大鼠海马组织NRF2、HO-1和NQO1蛋白表达水平升高，差异具有统计学意义（P<0.05）；与麦角硫因组相比，麦角硫因+ML385组大鼠海马组织NRF2、HO-1和NQO1蛋白表达水平降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。
2.5 麦角硫因对VD大鼠海马组织中SOD、GSH-Px和MDA水平的影响
与对照组相比，模型组大鼠海马组织SOD、GSH-Px水平降低，MDA水平增加，差异具有统计学意义（P<0.05）；与模型组相比，麦角硫因组大鼠海马组织SOD、GSH-Px水平升高，MDA水平降低，差异具有统计学意义（P<0.05）；与麦角硫因组相比，麦角硫因+ML385组大鼠海马组织SOD、GSH-Px水平降低，MDA水平升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。
2.6 麦角硫因对VD大鼠海马组织中IL-1β、TNF-α和IL-6的影响
与对照组相比，模型组大鼠海马组织IL-1β、TNF-α和IL-6水平增加，差异具有统计学意义（P<0.05）；与模型组相比，麦角硫因组大鼠海马组织IL-1β、TNF-α和IL-6水平降低，差异具有统计学意义（P<0.05）；与麦角硫因组相比，麦角硫因+ML385组大鼠海马组织IL-1β、TNF-α和IL-6水平升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。
3 讨论
VD发病涉及炎性、氧化应激、淀粉样血管病、代谢紊乱等多个机制［16］。较高的炎症标志物可能是神经血管单位损伤的基础。事实上，炎症和氧化应激损伤可能通过干扰神经血管耦合来改变神经元和蛋白质功能［17］。在本研究中，VD造模后第1次水迷宫测试中，38只大鼠中有36只大鼠平均逃避潜伏期与参考值之差占对照组平均逃避潜伏期的比例>20％，提示这36只大鼠造模成功。在给药结束后的水迷宫测试中，模型组及药物处理组较对照组大鼠的逃避潜伏期延长，表明大鼠对空间标志物的学习能力减退，在目标象限停留时间百分比降低，说明大鼠对空间标志物的记忆能力减退，提示VD模型大鼠出现了学习与记忆障碍。此外，本研究还表明麦角硫因改善了VD大鼠的空间学习能力和记忆能力以及海马组织病变。腹腔注射麦角硫因后，VD大鼠海马组织凋亡率降低，氧化应激水平及炎症损伤被抑制，而ML385逆转了麦角硫因对VD大鼠的改善作用。本研究表明，麦角硫因可以通过激活NRF2/HO-1信号通路发挥改善VD大鼠认知障碍的作用。
麦角硫因是一种天然强抗氧化剂，可以直接中和ROS和外源性物质，调节蛋白质结构和功能，并作为抗氧化和代谢酶的辅助因子，具有抗氧化和抗炎的作用［18］，同时有研究表明其还具有保护神经和心血管以及具有预防肝脏疾病等作用［19-21］。由于麦角硫因具有抗氧化性强、稳定性高、无毒性且能透过血脑屏障的特点，让其在中枢神经系统疾病治疗中具有良好的应用前景［22-24］。
NRF2/HO-1信号通路是细胞抗氧化防御的关键信号通路之一［25］，NRF2能够通过抗氧化反应元件（ARE）调节多种抗氧化剂及Ⅱ期解毒酶（HO-1、NQO1、SOD）的表达［26］。其中HO-1能催化促氧化剂血红素降解产生一氧化碳、铁以及胆绿素等代谢产物，从而发挥抗炎、抗氧化和抗凋亡等作用［27］。研究认为上调HO-1的表达有助于细胞抵御外界刺激，抑制氧化应激损伤［28］，且NRF2/HO-1信号通路在其他认知障碍疾病如阿尔茨海默病中具有神经保护的作用［29］。
研究表明，麦角硫因能通过激活NRF2/HO-1通路发挥抗氧化的功能，防止UVB照射后角质形成细胞中NRF2/HO-1通路和HSP70的下调来抑制成纤维细胞中胶原稳态的改变，并通过抑制ROS的产生和促凋亡蛋白（包括Caspase-8和PARP）的切割来保护角质形成细胞，还能降低旁分泌细胞因子，包括 IL-1β、IL-6和TNF-α［30］。麦角硫因还能通过上调Keap1-NRF2通路及其下游细胞保护性抗氧化剂预防糖尿病引起的心血管损伤［31］。本研究使用双侧颈总动脉永久性结扎法VD大鼠模型后，VD大鼠海马组织中NRF2、HO-1和NQO1的蛋白表达水平降低，麦角硫因会增加VD大鼠海马组织中NRF2、HO-1和NQO1的蛋白表达水平，并使VD大鼠海马组织免受氧化应激损伤和炎症反应，改善大鼠认知功能障碍。
综上，麦角硫因可以通过激活NRF2/HO-1信号通路，抑制VD大鼠海马组织凋亡水平、氧化应激损伤和炎症水平。但本研究未探讨麦角硫因在VD体外模型中的作用机制，也未在临床试验中进行验证，具有一定局限性。因此，本研究下一步将从临床水平及细胞水平进一步探讨麦角硫因对VD疾病的作用机制。
参考文献略
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