测序经常遇到套峰怎么办？手把手教你拆峰（R语言版）教程

在行CRISPR/Cas9系统进行对靶基因敲除，最后均需送sanger测序在DNA水平上进行验证。但是连接好的载体测序，有时却出现套峰，使得我们无法直接判断DNA双链编辑的最终情况。

测序结果

一条链的成功KO，测序峰图为单峰

双峰，导致无法判断另一条链的编辑情况

这时候，面临两个选择：第一就是重新再挑单克隆，送测序（多花钱又得多花时间）；第二就是利用工具，对双峰进行拆解，确定另一条链得编辑情况，最终确定CRISPR/Cas9达到敲除编辑。

原理很简单，就是其中一条链得编辑情况已经是确定得了，固定确定链得序列，那么，在双峰中就能拆出另一条链得序列，从而确定另一条链得编辑情况。

拆峰方法一：利用网页工具拆峰：Poly Peak Parser。但是该工具目前无法访问，所以还是不能长期依靠。

拆峰方法二：利用R语言版本拆峰，本地部署，永远不用担心耽误工作。

下面是R语言代码：

1. ##install package

2. BiocManager::install("sangerseqR")

3.  

4. ##load package

5. library(sangerseqR)

6.  

7. ##read reference sanger sequence

8. homosangerseq <- readsangerseq('sample_E11_2504244103J.ab1')

9.  

10. ##read the double-peak sanger sequence

11. hetsangerseq<-readsangerseq('sample_E12_2504244110J.ab1')

12. 

13. hetcalls<-makeBaseCalls(hetsangerseq, ratio =0.33)

14. 

15. ##transform sequences

16. ref<- subseq(primarySeq(homosangerseq,string= TRUE), start =30, width =500)

17. hetseqalleles<-setAllelePhase(hetcalls,ref, trim5 =0, trim3 =0)

18. hetseqalleles

19. 

20. ##sequence alignment

21. pa <- pairwiseAlignment(primarySeq(hetseqalleles)[1:400],secondarySeq(hetseqalleles)[1:400],

22. type ="global-local")

23. 

24. ##final results

25. writePairwiseAlignments(pa)

26.  

最终通过拆峰，得到另一条链得序列S1（截图所示得sencondary sequence）：

把S1复制出来，再拿到SnapGene中比对，即可确定另一条链的编辑情况：

两条链最终得编辑情况：

一条链删除了31bp

另一条链删除了1bp

均为非3的倍数。说明本克隆是KO成功的克隆，下一步直接可以WB验证蛋白水平。

可以清楚的看到，第12号克隆，即上述测序结果的克隆，为成功KO的克隆（即在DNA水平上验证，又在蛋白水平上验证）。

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