实验Protocol|全流程实打实过表达载体构建

在进行对靶基因功能进行操作时，常常需要把靶基因进行gain of function 操作。其中利用的就是通过过表达靶基因，然后看因过表达靶基因后的表型变化来确定靶基因的功能。笔者在网上看了很多教程，质量参差不齐，而且很多教程把简单问题复杂化，比如特别是涉及酶切位点原则时：1.选用载体有的，而靶基因没有的酶切位点；2.选用酶切活性好的，避免✳标记的酶等等。其实，看完很多网上的教程，仍然一头雾水。现在笔者介绍一个简单、高效、通用的过表达构建。不需要考虑复杂的酶切位点，而且几乎所有靶基因过表达构建通用本教程。

克隆过程示意图

1.      第一步：选用ligation independent Cloning（LIC）的载体：addgene #30124，#30125（mCherrry），#30127（GFP），其中一个，根据自己的需求选用：

2.      第二步：找到靶基因CDS序列：

进入Genome Browser网站（网址：https://genome.ucsc.edu/），以TP53为例，输入“TP53”：

选用MANE select的序列：

点击后进入新的页面，再点击：Genomic sequence：

进入新的页面后，勾选”CDS”，最后点击submit即可

最后得到TP53的CDS，可见以起始密码子ATG开头，终止密码子TGA结尾：

复制序列，并粘贴到SnapGene软件中。

3.      开始设计靶基因引物，以#30124为载体构建过表达，设计原则：

F primer：5´ -TACTTCCAATCCAATGCCACC ATGxxxxxxxxxxxxxx-3´

START target PCR oligo

其中，ATG为靶基因的起始密码子，xxxxxxxxxxxxxx为靶基因ATG后面的序列，一般选15-20个bp即可，根据Tm值调整PCR oligo长度，遵循一般PCR引物设计原则。

比如笔者设计TP53 F primer，

根据选定的序列，完整设计：

TP53 F primer：5´ -TACTTCCAATCCAATGCCACC ATG GAGGAGCCGCAGTCAGATCC – 3‘

反向引物设计原则：

Reverse primer 5´-TTATCCACTTCCAATG TTA TTA xxxxxxxxxxxxxxxx-3´

Stop Stop target PCR oligo

注意，在设计反向引物时，需要把CDS序列的终止密码子去掉。比如在TP53 CDS序列末端，选定PCR oligo，切记勿选择TGA终止密码子：

最后，设计完成反向引物：

TP53 R primer 5´-TTATCCACTTCCAATG TTA TTA GTCTGAGTCAGGCCCTTCTGTCTTGAAC-3´

最终得到TP53的正反向引物，交付公司合成即可：

TP53 F primer：5´ -TACTTCCAATCCAATGCCACC ATG GAGGAGCCGCAGTCAGATCC – 3‘

TP53 R primer 5´-TTATCCACTTCCAATG TTA TTA GTCTGAGTCAGGCCCTTCTGTCTTGAAC-3´

第四步：酶切线性化载体，跑核酸胶回收。

选用SspI酶(NEB)对30124进行线性化,切胶回收线性化片段。

酶切体系：

第五步：提取选定细胞的总mRNA（参考先前教程），把靶基因CDS片段通过设计的引物P下来，然后跑核酸胶回收。

PCR反应体系，根据实验室情况，选用高保真酶，笔者实验室选用诺维赞的P510高保真酶，反应体系如下：

第六步：对回收的线性化30124载体和TP53-CDS片段进行LIC前预处理：

（1）     线性化30124预处理：

（PCR仪孵育： 22°C  30 minutes ；然后 75°C  20 minutes。）

第七步：LIC连接

在第六步预处理完成的#30124载体和TP53-CDS，即可进行LIC连接：

（PCR仪孵育： 22°C 30 min ；然后 75°C 20 min。）

第八步：DH5α感受态转化,可根据实验室情况选用化学感受态细菌:

转化程序：

（1）.-80°C取出50µLDH5α感受态细菌，冰中融化，约10-15min；

（2）.加入LIC连接完成的构建载体，冰中孵育30min；

（3）42°C，45sec 热击；

（4）再冰中孵育10-15min；

（5）在含有氨苄抗性的LB板中，均匀涂抹，倒置，37°C孵育过夜；

（6）14-16h后，挑单克隆，摇菌送测序验证。

每日一言：爱自己！！！做科研!!! 每文格言。(培根，英国散文家，哲学家)：“如果问在人生中，最重要的才能是什么，第一，无所畏惧;第二，无所畏惧;第三，还是无所畏惧。”

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