Transwell细胞迁移/侵袭实验--包教包会的实验protocol

一、概述

Transwell实验是一种体外研究细胞迁移和侵袭能力的经典方法，广泛应用于肿瘤转移、免疫细胞趋化、药物筛选及细胞间相互作用等领域。其核心是通过多孔膜分隔上下腔室，模拟细胞在趋化因子梯度下的跨膜运动。迁移实验评估细胞定向运动能力，而侵袭实验需额外包被基质胶（如Matrigel）以模拟细胞外基质（ECM），检测细胞降解基质并穿透膜的能力^1，2。

（图1 Transwell基本流程示意图）

二、实验原理

Transwell系统由一个带有多孔聚碳酸酯膜的上腔（内插）和下腔（培养孔板）组成。上腔中接种细胞，膜孔径范围0.4 - 8 μm。

² 细胞迁移实验（Migration）：细胞穿过膜，无需基质。

² 细胞侵袭实验（Invasion）：膜表面涂覆 Matrigel，模拟基底膜，观察细胞穿越基质的能力。

细胞在趋化因子的刺激下迁移或侵袭至膜的另一侧，通过固定染色和显微镜计数，量化其运动能力。

（图2 Transwell基本实验原理示意图）

三、实验材料

表1 Transwell实验材料及实验

四、实验步骤

Transwell细胞迁移/侵袭实验

（一）准备工作

若为侵袭实验，Transwell膜面加Matrigel。在4℃条件下(冰上操作)将Matrigel胶用无血清的细胞培养基进行稀释。取50-100μl添加到Transwell小室，37℃培养箱中孵育3h凝胶化。

（二）制备细胞悬液

取数生长期细胞用0.25%胰酶消化细胞，等待细胞变圆后收集细胞，1000rpm离心3min，离心后弃去上清，用PBS洗1遍，接着用无血清培养基悬浮细胞，调整细胞密度至1×10⁵cells/ml。

（三）接种细胞

在24孔板下室加入500μL含10% FBS或趋化因子的培养基，然后用镊子将Transwell小室置于24孔板内，取细胞悬液200μL加入上室，最后放入培养箱中培养24h。

（四）染色与计数

1.细胞固定：用镊子小心取出小室，吸干上室培养基，用棉签轻轻擦拭上室内的细胞。取新的24孔板加入4%多聚甲醛600μL，将小室放入后室温固定30min。

2.细胞染色：取出小室，吸干上室固定液，移到预先加入约800μl 0.1%结晶紫的孔中，室温染色20min。取出小室，用PBS轻柔清洗2次，除去未与细胞结合的结晶紫。

3.细胞计数：在显微镜下进行观察和拍照，随机选取5个视野(上、下、中央、左、右各1个)计数呈紫色的阳性细胞。

五、注意事项

表2 实验过程注意事项

六、遇到问题及解决方案

表3 实验过程可能遇到的问题及解决方案

参考文献：

1. Transwell In Vitro Cell Migration and Invasion Assays. Methods Mol Biol. 2023; 2644: 349–359. doi: 10.1007/978-1-0716-3052-5_22.

2. In vitro cell migration and invasion assays. J Vis Exp. 2014 Jun 1;(88):51046. doi: 10.3791/51046. PMID: 24962652; PMCID: PMC4186330.