多组学揭秘戊己丸作用机制：通过乳酸菌-IAA轴调控AhR信号通路改善结肠炎
近年来，越来越多的证据表明，肠道微生物通过代谢色氨酸产生的多种小分子代谢物，能通过激活如芳香烃受体（AhR）等信号通路，维持肠屏障完整性并调控炎症反应。与此同时，经典中药复方戊己丸（Wuji Wan, WJW）因其在调节消化系统疾病方面的独特优势，引起了研究者的极大兴趣。2025年1月由王嗣岑（西安交通大学药学院、陕西省心血管药物筛选与分析工程研究中心、西藏大学医学院药学系）、吕海涛（香港浸会大学中药学院、上海交通大学瑞金医院上海血液研究所、系统生物学重点实验室）团队发表在《Acta Pharmaceutica Sinica B》（最新影响因子/中科院分区：14.7/1区TOP）题为“Gut microbiota-derived tryptophan metabolites regulated by Wuji Wan to attenuate colitis through AhR signaling activation”的研究聚焦于WJW，通过整合功能代谢组学和肠道菌群测序技术，系统探究其通过调控色氨酸代谢产物激活芳香烃受体（AhR）信号通路改善结肠炎的分子机制。研究不仅揭示了WJW通过菌群-代谢物-宿主互作缓解IBD的新机制，也为基于微生物代谢的中药干预策略提供了科学依据。
亮点
- 整合多组学策略：采用功能性代谢组学、16S rRNA基因测序、细胞学及分子生物学手段，展示了戊己丸在分子、组织以及整体水平上对结肠炎的调控效果。
- 机制深入：研究不仅描述了戊己丸改善结肠炎症状的表型变化，还阐明了其作用机制——通过调控乳酸杆菌丰度，促进色氨酸代谢物（尤其是IAA）产生，并通过AhR信号通路恢复肠上皮紧密连接和黏液层结构，从而减轻炎症。
研究方法
1) 动物模型研究
C57BL/6J小鼠分为对照组、DSS结肠炎模型组、WJW低/高剂量组（150/300 mg/kg）和阳性药5-ASA组，连续10天灌胃给药，同时以2.5% DSS诱导急性结肠炎。
- 表型评估：监测体重变化、疾病活动指数（DAI）、结肠长度/重量比、脾脏指数，检测结肠组织MPO活性及炎症因子水平（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10）。
- 肠道屏障功能：FITC-葡聚糖检测肠道通透性，Western blot和免疫荧光分析紧密连接蛋白（ZO-1、Occludin、Claudin-2）及AhR/CYP1A1表达。
- 菌群依赖性实验：广谱抗生素清除小鼠肠道菌群后，验证WJW的疗效消失。
2) 微生物组分析：16S rRNA测序分析粪便菌群组成，LEfSe分析差异菌群。
3) 代谢组学：UHPLC-TQ/MS检测血清和粪便中色氨酸代谢产物（IAA、IA、IPA等），PLS-DA模型筛选差异代谢物。
4) 体外验证：LPS诱导的Caco-2细胞模型中，评估WJW和IAA对炎症因子及AhR信号的影响，AhR拮抗剂CH-223191阻断实验。
前言
人体肠道中约有1014个微生物，这些微生物与宿主经过数千年的共同进化，形成了一种复杂且互惠的共生关系。近十年来，研究者们广泛关注肠道菌群在多种疾病发病机制中的作用。肠上皮不仅承担着物理屏障的职能，还具有化学防御功能，能够保护黏膜及邻近器官免受有害微生物的侵袭。然而，当肠道菌群出现紊乱（肠道失调）时，菌群组成、结构和功能发生变化，这将破坏肠上皮屏障的完整性，导致细菌内移和免疫反应激活，进而促进炎症性肠病（IBD）的发生、发展及加重。
近年来，越来越多的证据指出，肠道菌群所产生的小分子代谢物在维持肠屏障完整性中起着关键作用。目前研究较为深入的三大类菌群代谢产物分别是：①由微生物直接合成的短链脂肪酸（SCFAs），②肝脏初步生成并经肠道菌群修饰的胆汁酸（BAs），以及③由食物中色氨酸经肠道菌群代谢生成的色氨酸衍生物。这些代谢物往往通过充当信号分子或代谢底物，激活肠黏膜内的免疫反应和调节炎症过程。例如，SCFAs能够通过抑制病原体生长、降低肠道炎症及调节紧密连接蛋白结构而增强肠屏障；而二级胆汁酸则可通过激活包括孕烷X受体和法尼酰X受体在内的多种受体，促进肠上皮再生、防止屏障功能失调和细菌内移。此外，肠道菌群对色氨酸的代谢生成的吲哚类衍生物，可以通过激活芳香烃受体（AhR）来调控肠屏障功能，从而有效减轻因促炎细胞因子引起的屏障损伤。因此，针对肠道微生物调控的代谢产物以恢复肠屏障功能，可能成为治疗IBD的一种有效策略。
传统中药在治疗IBD方面展现出精准的疗效、低复发率及较少副作用等优势。大量研究表明，中药能通过多成分、多靶点作用调控肠道菌群，进而改善肠屏障功能。在众多中药方剂中，戊己丸是一种具有悠久临床应用历史并载于《中国药典》中的经典方剂，其在调节多种胃肠疾病中表现出的益处引起了广泛关注。戊己丸由白芍、吴茱萸和黄连按一定比例配伍组成，近年来研究发现，戊己丸能够缓解腹泻、改善结肠运动并恢复肠道菌群及上皮屏障。因此，该研究利用DSS诱导的小鼠急性结肠炎模型，系统评估了戊己丸在改善肠道菌群失调、调控色氨酸代谢、激活AhR信号通路以及修复肠上皮屏障方面的作用，为IBD的防治提供了新的理论依据和实践思路。
结果
UPLC-QTOF-MS 准确鉴定WJW成分
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图1 基于LC-QTOF-MS/MS化学轮廓分析技术精准鉴定戊己丸九种主要化学成分
(A) 九种成分的提取离子流色谱图：小檗碱、吴茱萸碱、芍药苷、药根碱、苯甲酰芍药苷、芍药内酯苷、木兰碱、吴茱萸次碱和吴茱萸酮。(B) 戊己丸提取物中九种特征成分与其标准品的MS/MS质谱比对图。
为明确WJW的主要化学成分，该研究采用UPLC-QTOF-MS技术进行化学轮廓分析。通过与标准品比对，鉴定出WJW中的9种核心成分：黄连来源的木兰碱（magnoflorine）、小檗碱（berberine）、药根碱（jatrorrhizine）；吴茱萸来源的吴茱萸碱（evodiamine）、吴茱萸次碱（rutaecarpine）、吴茱萸酮（evodine）；以及白芍来源的芍药内酯苷（albiflorin）、苯甲酰芍药苷（benzoylpaeoniflorin）、芍药苷（paeoniflorin）（图1A）。这些成分在WJW提取物中均稳定检出（图1B），且其结构特征见图S1。值得注意的是，尽管小檗碱、芍药苷和吴茱萸碱的口服生物利用度较低，但它们可通过调节肠道菌群发挥显著的抗结肠炎活性，提示WJW的疗效可能依赖于菌群调控机制。
WJW缓解小鼠结肠炎症状并减轻炎症反应
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图2 戊己丸改善DSS诱导结肠炎病理表型并减轻肠道炎症
采用2.5%DSS饮水法连续10天诱导小鼠结肠炎模型。实验组分别给予戊己丸（150/300 mg/kg）或5-氨基水杨酸（5-ASA，100 mg/kg）灌胃治疗：(A) DSS处理期间各组小鼠体重变化率与疾病活动指数（DAI）评分（n=10）(B) 结肠大体观与脾脏指数（结肠重量/长度比、脾脏/体重比）（n=10）(C) 结肠组织H&E染色（标尺100μm）及病理评分（n=3）(D) 结肠髓过氧化物酶（MPO）活性与炎症因子（IL-6/IL-1β/TNF-α/IL-10）水平（n=3）。数据以均值±SEM表示，***P<0.001 vs对照组；###P<0.001 vs模型组；&&&P<0.001 vs高剂量组（ANOVA+Dunnett检验）
该研究采用DSS诱导的小鼠急性结肠炎模型，模拟人类IBD的典型症状（如体重下降、血便）。WJW（150或300 mg/kg）或阳性对照药5-ASA（100 mg/kg）连续灌胃10天。结果显示：
- 表型改善：DSS组小鼠从第4天起出现显著体重下降和疾病活动指数（DAI）升高，而WJW干预以剂量依赖性方式逆转这一趋势（图2A）。
- 炎症指标：DSS组结肠缩短和脾脏肿大（炎症标志），WJW显著降低结肠重量/长度比和脾脏指数（图2B）。
- 组织学分析：WJW修复结肠黏膜损伤，恢复隐窝结构，减少炎性细胞浸润（图2C），且高剂量WJW效果优于5-ASA。
- 生化指标：WJW抑制结肠髓过氧化物酶（MPO）活性（中性粒细胞浸润标志），降低促炎因子（TNF-α、IL-1β、IL-6），提升抗炎因子IL-10水平（图2D）。
WJW改善结肠炎模型中肠道菌群失调
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图3 戊己丸重塑DSS结肠炎小鼠肠道菌群结构
16S rRNA测序分析显示：(A) α多样性（Shannon指数与OTUs）（n=7-8）(B) 基于OTU水平的Bray-Curtis主坐标分析（PCoA）（n=9-10）(C) 门水平菌群组成与厚壁菌/拟杆菌比值（n=8）(D-E) 科/属水平优势菌群相对丰度（对照组vs模型组vs治疗组）(F) LEfSe分析鉴定标志性差异菌群（LDA评分>4）。***P<0.001 vs对照组；##P<0.01 vs模型组（Wilcoxon秩和检验）
通过16S rRNA测序分析粪便菌群发现：
- α多样性：DSS组菌群多样性和丰富度（Shannon指数和OTUs）显著降低，WJW干预后恢复（图3A）。
- β多样性：主坐标分析（PCoA）显示WJW组菌群结构更接近对照组（图3B）。
- 菌群组成：
- 门水平：DSS组厚壁菌门（Firmicutes）减少，拟杆菌门（Bacteroidetes）增加，WJW部分恢复F/B比值（图3C）。
- 属水平：DSS组乳酸菌（Lactobacillus）丰度从52%降至7%（P<0.001），WJW提升至21%（P<0.05）；同时WJW增加阿克曼菌（Akkermansia）和双歧杆菌（Bifidobacterium）等有益菌（图3D-E）。
- 标志性菌群：LEfSe分析显示WJW组中乳酸菌科（Lactobacillaceae）和毛螺菌科（Lachnospiraceae）显著富集（图3F）。
菌群依赖性验证：广谱抗生素（ABX）清除肠道菌群后，WJW对结肠炎症状、屏障功能和炎症指标的改善作用完全消失（图S2），证实其疗效依赖肠道菌群。
WJW给药样本富集肠道菌群来源的色氨酸代谢物
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图4 戊己丸纠正结肠炎代谢紊乱并富集菌源性色氨酸代谢物
靶向代谢组学分析发现：(A-B) 粪便/血清代谢物PLS-DA得分图（n=8）(C-D) 差异代谢物热图（红色箭头示戊己丸回调代谢物）(E) 代谢通路富集分析（色氨酸代谢通路显著富集）(F-G) 粪便/血清色氨酸代谢物（IAA/IA/IPA/5-HT等）相对含量（n=8）(H) 色氨酸代谢物与结肠炎参数的相关性网络（红色示正相关）(I) 乳酸菌属与吲哚-3-乙酸（IAA）含量的Spearman相关性。*P<0.05，**P<0.01（Mann-Whitney U检验）
通过靶向代谢组学分析粪便和血清代谢物：
- 代谢轮廓：PLS-DA模型显示WJW显著逆转DSS引起的代谢紊乱（图4A-B）。
- 差异代谢物：WJW上调29种粪便代谢物（如IAA、IPA）和6种血清代谢物（图4C-D，表S4-S5），抗生素处理可消除此效应（图S3）。
- 通路富集：色氨酸代谢通路（涉及IAA、IA、5-HT等）在拓扑图中显著富集（图4E）。
- 关键代谢物：
- 粪便：DSS组IAA和IPA水平降低，WJW显著提升；IA水平在WJW组增加3倍（图4F）。
- 血清：WJW恢复DSS导致的IAA和5-HT下降（图4G）。
- 相关性分析：血清和粪便IAA水平与乳酸菌丰度呈显著正相关（图4I），且与结肠炎表型（体重、DAI、炎症）密切相关（图4H）。
WJW通过增强紧密连接蛋白表达恢复肠上皮屏障功能
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图5 戊己丸缓解DSS诱导的肠道屏障损伤
(A) 肠道通透性（FITC-葡聚糖渗透率）（n=3）(B) 紧密连接蛋白（Tjp1/Ocln/Cldn2等）mRNA表达（n=3）(C) ZO-1/Occludin/Claudin-2/Mucin-2蛋白免疫印迹(D) ZO-1/Occludin免疫荧光与PAS染色杯状细胞（标尺100μm）。***P<0.001 vs对照组；###P<0.001 vs模型组；&&&P<0.001 vs高剂量组
- 通透性：DSS组血清FITC-葡聚糖渗透率升高，WJW显著降低（图5A）。
- 紧密连接蛋白：WJW上调ZO-1、Occludin、Mucin-2 mRNA和蛋白表达，下调渗漏蛋白Claudin-2（图5B-C）。
- 免疫荧光：WJW恢复结肠上皮中ZO-1和Occludin的膜定位（图5D）。
- 杯状细胞：PAS染色显示WJW修复DSS导致的杯状细胞丢失（图5D）。
WJW通过激活AhR信号途径改善结肠炎，且依赖肠道菌群
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图6 戊己丸通过菌群依赖的AhR信号通路维护肠屏障完整性
(A-C) AhR信号通路关键分子（Ahr/Cyp1a1/Mylk）mRNA与蛋白表达（n=3）(B) 结肠IL-22含量（n=3）(D) AhR免疫荧光染色（红色：AhR，蓝色：细胞核）（标尺50μm）(E-G) Caco-2细胞模型：(E) 戊己丸（250-500 mg/L）对细胞活性的影响（n=3）(F) 炎症因子（TNF/IL1B/IL6）mRNA水平（n=3）(G) 肠屏障蛋白与AhR通路蛋白表达。***P<0.001 vs对照组；###P<0.001 vs LPS组；&&&P<0.001 vs抗生素干预组
- AhR激活：DSS抑制AhR和CYP1A1表达，WJW显著提升其mRNA和蛋白水平（图6A-C），免疫荧光验证AhR核转位（图6D）。
- 下游机制：WJW抑制MLCK-pMLC磷酸化通路，增加IL-22分泌（图6A-C），抗生素处理可阻断此效应。
- 体外验证：在LPS诱导的Caco-2细胞中，WJW虽降低IL-1β表达，但未直接激活AhR或上调紧密连接蛋白（图6F-G），进一步证实其作用依赖菌群代谢。
- AhR拮抗实验：使用CH-223191抑制AhR后，WJW对结肠炎症状和屏障蛋白的改善作用完全消失（图S4）。
吲哚-3-乙酸（IAA）通过AhR通路缓解结肠炎，优于吲哚丙烯酸（IA）
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图7 吲哚-3-乙酸（IAA）较吲哚丙烯酸（IA）展现更优抗结肠炎效果
(A) 体重变化与DAI评分（n=6）(B) 结肠大体观与脾脏指数（n=6）(C) MPO活性与炎症因子水平（n=3）(D) 肠道通透性（n=3）(E) ZO-1/Occludin/Mucin-2蛋白表达（n=3）(F) 紧密连接蛋白免疫荧光定位（标尺50μm）。***P<0.001 vs对照组；###P<0.001 vs模型组
- 体内疗效：补充IAA或IA（20 mg/kg）均缓解DSS结肠炎，但IAA对屏障功能的修复效果更强（图7A-F）。
图8 IAA通过AhR通路体外保护肠上皮屏障
(A) IAA（0.1-1 mmol/L）对Caco-2细胞活性的影响（n=3）(B) 炎症因子mRNA表达（n=3）(C) 肠屏障蛋白与AhR通路蛋白免疫印迹(D) ZO-1/Occludin/AhR免疫荧光定位（标尺50μm）。*P<0.05 vs对照组；##P<0.01 vs LPS组；&P<0.05 vs AhR拮抗剂组
- 体外机制：IAA（1 mmol/L）在Caco-2细胞中抑制LPS诱导的炎症因子（TNF、IL-1β），上调ZO-1/Occludin，且此效应可被AhR拮抗剂阻断（图8B-D）。
讨论总结
- 菌群重塑与代谢调控：WJW显著恢复DSS引起的菌群多样性下降，富集乳酸菌属（尤其是L. murinus），促进Trp代谢向IAA生成倾斜，抗生素清除实验证实其疗效依赖菌群活性。
- AhR信号的核心作用：IAA通过激活AhR上调紧密连接蛋白（ZO-1、Occludin）和黏蛋白Muc2，抑制MLCK-pMLC磷酸化通路，改善肠屏障通透性。AhR拮抗剂可完全阻断WJW的疗效。
- 临床转化潜力：靶向菌群代谢的AhR激活策略为IBD治疗提供新思路，但需进一步研究WJW在人类IBD患者中的疗效及个体化菌群调控方案。
结论
戊己丸通过恢复肠道菌群平衡，富集乳酸菌属并促进色氨酸代谢产物吲哚-3-乙酸的生成，激活AhR信号通路，从而抑制炎症反应、修复肠屏障功能并缓解实验性结肠炎。该研究首次阐明中药复方通过菌群代谢-宿主互作改善IBD的分子机制，为开发基于微生物代谢调控的IBD治疗策略提供了理论依据。未来研究需进一步验证WJW在临床患者中的疗效，并探索其活性成分与菌群代谢网络的精准互作机制。
参考文献
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