mNGS 报告如何解读？专家共识来了！

宏基因组二代测序 (mNGS) 是近年来兴起的基于核酸检测的微生物鉴定技术，由于其非预设性、高通量等优点而得到广泛应用。下呼吸道感染 (LRTI) 主要包括社区获得性肺炎（CAP）、医院获得性肺炎 (HAP)、免疫抑制宿主肺炎、慢性阻塞性肺疾病急性加重、支气管扩张症合并感染等类型，临床表现多样，感染微生物种类复杂，感染和定植鉴别困难，加之 mNGS 技术本身存在的局限性，mNGS 诊断效力的发挥有赖于选择恰当患者、采用适宜标本以及进行合理的解读。

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哪些情况需送检 mNGS？

(1) 免疫抑制宿主疑似发生 LRTI 下呼吸道感染且临床表现提示非 CAP 常见病原微生物所致者；

(2) LRTI 下呼吸道感染患者发病初期即出现需要使用血管活性药物的感染性休克、需要有创机械通气的呼吸衰竭、多脏器功能不全等危及生命的状况时；LRTI 经规范经验性抗感染治疗 48~72 h 后，感染症状仍持续加重或影像学快速进展者；

(3)  聚集性发病疑似具有传染性、但无法明确病原体的 LRTI；有特殊病史 (如近期境外或野外旅游史) 且经验性治疗无效，病情较为严重的 LRTI；临床考虑特殊病原体 (如钩端螺旋体、嗜肺军团菌、鹦鹉热、衣原体等) 感染且病势迅疾或迁延者，常规培养困难或所在医疗机构无法提供可靠的传统检测方案时；

(4)  患者有 LRTI 症状或影像表现，经规范抗感染治疗后病灶吸收延迟、病程迁延，需鉴别是否由非感染性疾病所致 (如结缔组织疾病的肺部累及、 肺淋巴瘤等)，可以在常规病原微生物检测、感染生物标志物、病理等相关检查同时送检 mNGS 以帮助鉴别诊断。

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哪些情况不建议送检 mNGS？

(1)  免疫功能健全宿主罹患 LRTI（包括重症肺炎)，经过规范的经验性抗感染治疗病情已好转；

(2) LRTI 已通过其他方法获得病原学结果，与临床特点相符，或针对性治疗有效；

(3)  无法获取优质标本。

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mNGS 标本类型有哪些？

在 LRTI 的病原微生物诊断中，可用于 mNGS 检测的标本包括痰 (含诱导痰)、气管吸引物、支气管肺泡灌洗液（BALF）、经支气管肺活检（TBLB）标本、经支气管内超声（EBUS）活检标本、经皮肺穿刺活检标本、血液等。

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mNGS 送检及保存要求

(1) 下呼吸道标本：包括痰 (含诱导痰)、BALF、肺炎旁胸腔积液等，原则上应在采集后立即送检。若标本不能立即送检，标本采集时间与检测时间间隔 ≤ 24 h，可在 2~8 ℃ 保存。若标本采集时间与检测时间间隔 > 24 h，DNA 测序标本保存时间 ≤ 2 周时可储存在 -20 ℃ 冰箱，保存时间超过 2 周则需储存在 -80 ℃ 冰箱；需要进行 RNA 测序的标本如果保存时间 > 24 h，均应保存在 -80 ℃ 冰箱。对于短期不做检测的液体样本，冻存前应分装保存在冻存管 (≥ 500 μL/管) 中。

(2)  血标本：采集后 4 ℃ 保存不超过 8 h，如果需要长期保存，分离血浆后 4 ℃ 可保存 24 h，长期保存于 -80 ℃ 冰箱。

(3)  组织标本：来自感染部位的穿刺或手术切除组织标本，应保存在无菌生理盐水或者 Hank′s 液中，4 ℃ 保存不超过 24 h 。如果需要长期保存，小块组织可以不加保存液立即 -80 ℃ 冻存，穿刺活检标本置于无菌生理盐水 -80 ℃ 冻存。

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标本运输的要求

(1) 24 h 内送抵实验室并开始检测，可考虑冰袋低温运输

(2) 24~72 h 内送抵应干冰运输，送抵后应立即进行标本前处理和核酸提取。

需要进行去宿主核酸处理的标本保存和运输注意事项：除了上述注意事项外，此类标本一般要尽量保证病原微生物完整性，避免碾磨或多次冻融。

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哪些情况需要在 DNA 测序的同时送检 RNA 测序？

RNA 病毒引起的 LRTI 通常有一定的季节性、流行性或地域性。建议检测方法首选单重或多重 PCR 检测或相应的抗原检测。若当地医疗机构无相应检测能力，或 PCR 检测阴性但依然高度怀疑时，可在送检 mNGS DNA 测序的同时进行 RNA 测序。

下列临床情况可供参考：

(1) 呼吸道 RNA 病毒感染流行季节 (主要是冬春季节以及南方的夏季）有相应流行病学史的患者出现疑似呼吸道病毒感染的临床和 (或) 影像表现。

(2) LRTI 合并以下情况时：免疫抑制宿主；发热伴严重血小板减少或凝血功能障碍; 急性肝肾功能损害；急性神经系统症状。

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mNGS 报告中内容如何有哪些？如何解释？

mNGS 检测报告从检测技术角度应包括如下内容：标准化后的微生物特异性读长 (reads) 数/序列数、标准化中英文名称、相对丰度、阈值、基因组覆盖度图。

可选内容有：相应部位病原微生物列表、微生物序列与人源核酸序列的比值、测得总序列数、质量合格序列数、可比对至微生物数据库序列数、测序质控图、耐药基因、毒力基因等。

报告微生物的版块可按细菌、病毒、真菌、寄生虫、特殊病原体 (支原体、衣原体、立克次体等）5 大类分别列举。

主要参数定义及其意义：

(1) reads：测序仪单个测序反应所得到的碱基序列，二代测序平台一般长度为 50~75 bp 的片段。

(2) reads 数：指测序获得的某种微生物属/种碱基序列的数量。病原微生物属/种水平上检出的 reads 数与当次实验的总测序数据量直接相关，为避免总测序数据量高低的干扰，应对检出 reads 数进行标准化之后进行报告。

(3) 覆盖率：指达到给定深度的测序碱基占整个基因组或目标区域的百分比。没有达到给定深度的部分称为盲隙 (gap)。通常同时使用覆盖率和深度描述测序结果。

(4) 相对丰度：指除去宿主序列之后，某微生物序列在相应 5 大类微生物类别中的分布比例。丰度越高，表示该微生物所占比例越高。它只能指示同一样本中某微生物的相对数量，不能用于不同样本之间的比较。

(5) Q 值：指质量分值，用于衡量测序准确度，公式为 Q =- 10log10P，其中 P 代表该碱基被测序错误的概率。如 Q20 表示该碱基检测错误的概率为 1%。

(6) RPM：每一百万条测得序列包含的阳性 reads 数 (reads per million)。

(7) RPTM：每一千万条测得序列包含的阳性 reads 数 (reads per ten million)。

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解读 mNGS 报告的流程

(1)  分析报告质量，判断结果可信程度：根据送检标本类型、报告形式及内容判断检测结果是否规范可信。

(2)  对 mNGS 检测出的微生物进行分级：判断 mNGS 检出的微生物为致病性微生物、条件致病微生物还是定植微生物（参照表 1）。

致病性微生物在肺内定植可能性低，阳性结果多考虑为导致感染的病原。

条件致病微生物需结合患者的宿主因素、血液理化指标和影像学特征、抗感染药物用药史及治疗反应、传统微生物学检测结果综合分析进一步判断是否致病。

定植微生物引起 LRTI 的可能性低，多不考虑致病，但吸入性肺炎、肺脓肿、脓胸等混合性感染时，口腔定植微生物也可能致病。经皮穿刺肺活检标本或胸腔积液标本检出的皮肤定植微生物，通常不致病。

遇到不熟悉的微生物，可借助病原检索工具 https：//www.chinapneumonia.cn/pathogens 查询其在既往感染性病例中的报道。

表 1 下呼吸道感染微生物列表（点开放大看）

(3) 根据临床特征，结合 mNGS 微生物分级进行临床决策 (图 1)：如确定为致病病原体 (注：此处致病病原体为临床决策后的微生物分级，不同于上文致病性微生物），可根据该结果进行针对性治疗。

如判断为可能致病病原体，则需评估患者病情状况：危重症患者，可结合临床特征先根据 mNGS 结果调整抗感染方案，同时寻求其他支持证据 (如临床微生物室涂片/培养结果、抗原/抗体检测结果、PCR 检测结果等) 综合判断其致病的可能性和进行针对性治疗的必要性；非危重症患者可先寻求其他支持证据，再调整治疗方案。

(4) mNGS 阴性结果的临床决策：若 mNGS 结果为阴性，但综合临床特征，仍强烈怀疑为感染性疾病，则建议对报告中的背景微生物、原始数据列表或其他病原微生物检测结果进行分析。若临床特征支持非感染性疾病，应对原发疾病进行诊治。

(5) 组织多学科会诊（MDT）：若经过以上流程，仍无法确认致病病原体，可组织 MDT 讨论。

(6)  经验总结：鉴于 mNGS 用于诊断 LRTI 尚缺乏充分的循证医学证据，因此，临床医师在使用每一例报告后应进行回顾性分析总结，积累临床经验。

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如何对 mNGS 报告中的微生物进行致病概率分级？

根据微生物在下呼吸道的致病性特征，初步分为致病性微生物、条件致病微生物和定植微生物。条件致病微生物的判断，需要结合患者的宿主因素、血液理化指标和影像学特征、抗感染药物用药史及治疗反应、传统微生物学检测结果综合分析。

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mNGS 阴性报告如何处理？

mNGS 可能出现阴性结果，即未报告明确病原体。对此应结合临床和常规微生物实验室检测结果，综合判断是真阴性还是假阴性。真阴性指患者肺内病灶并非是感染性疾病所致，如弥漫性间质性改变可能为结缔组织疾病肺累及或其他 弥漫性实质性肺疾病（DPLD）。

假阴性是指未能检出感染致病微生物。通常见于以下情况：

(1) 技术原因而导致的假阴性，例如部分呼吸道病原微生物外壁很厚或脂质成分高，核酸提取过程中难以破壁，致核酸未彻底释放，如曲霉属、毛霉目、隐球菌属和诺卡菌属、分枝杆菌属等；标本储存或者运输问题致样本核酸降解，如流感病毒等 RNA 病毒易出现该情况；

(2) 所使用的数据库不全，导致检出病原微生物序列未准确注释；

(3) 生信分析错误而致漏报致病微生物；

(4) 标本中人源核酸过高；

(5) 样本中病原微生物载量低于 mNGS 最低检测下限，或测序数据量太低未能覆盖到该病原微生物，例如已接受有效抗微生物药物治疗而导致病原微生物负荷显著降低而难以被检出；

(6) 采样不规范或标本类型不合适。

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mNGS 报告中出现多种病原微生物如何解读？

mNGS 检测中出现多种病原微生物时，推荐首先通过显微镜检查、培养、抗原、PCR 等方法确认，并结合临床特征解读。必要时可通过不同部位标本 mNGS 检测结果进行相互印证。

mNGS 可在一份标本中检测到多种微生物，当出现以下情况时，考虑其中一种或多种微生物为假阳性结果：

(1) 标本质量不合格；

(2) 标本采集、送检过程受呼吸道定植菌、皮肤定植菌、环境菌、工程菌的污染；

(3) 检测过程中背景菌的质量控制不严格；

(4) 患者的职业和生活环境、基础疾病、临床特点和影像特征与检出的微生物不相符；

(5) 无法用其他微生物学方法验证；

(6) 治疗反应和疾病转归与检出的微生物不相符。

以下临床场景多支持 mNGS 检出的多病原微生物为真阳性结果：

(1) 误吸风险或明确误吸史的患者，出现多种常见口腔定植菌，需考虑吸入性肺炎/肺脓肿。此类病例常可同时在下呼吸道标本涂片和 (或) 培养中检出相应的混杂菌群。

(2) CAP 患者有时会出现细菌、非典型病原体、呼吸道病毒等混合感染。

(3) 免疫缺陷宿主 LRTI 常发生细菌、真菌、病毒、分枝杆菌等病原微生物的混合感染。

案例复习：

场景 1：谨慎分析低序列数的病原结果

患者女，52 岁，既往体健，因「阵发性咳嗽、咳痰 3 周余」入院。外院胸部 CT 可见双肺多发实变及磨玻璃密度影，考虑感染性病变，给予莫西沙星治疗后症状未改善。

入院后体检未见明显阳性体征，血常规、CRP、PCT、血清 GM 和 G 实验正常，ANA 抗体谱和 ANCA 相关抗体均阴性。ESR 为 63 mm/1 h，复查胸部 CT 仍示双肺多发实变影及磨玻璃影，较前片无明显吸收，且出现新发病灶。遂行支气管镜检查，BALF GM 试验阴性，但 BALF mNGS 回报烟曲霉阳性 (reads 数 2)。如何解读此项 mNGS 结果并进行处理？

A：考虑侵袭性肺曲霉病，加用抗曲霉治疗；

B：排除曲霉感染，综合临床资料考虑非感染性疾病 可能；

C：进一步获取病理及其他病原学证据，如肺活检标本；

D：等待痰培养结果回报，再考虑抗曲霉治疗。

正确答案

C

解析：曲霉属于厚壁微生物，mNGS 检测易出现假阴性， 若是检出低 reads 数曲霉 (reads 数 ≤ 3)，需要结合其他临床特征综合分析。本例患者中年女性，无免疫功能低下相关的宿主因素，临床表现不符合肺曲霉病。从微生物学证据分析，患者 BALF 和血标本的 GM 均为阴性，仅 mNGS 报告曲霉 2 reads。因此根据目前的证据情况，不足以明确诊断肺曲霉感染，选择方案 C。

患者转归：该患者最终行经皮肺穿刺活检，肺组织未检出曲霉，同时病理结果报告符合机化性肺炎。最终修正诊断为隐源性机化性肺炎 (COP)，给予激素治疗后病变吸收。

场景 2：mNGS 阴性结果的解释，真阴性还是假阴性？

患者男，33 岁，职业是交通协警，体检发现左上肺沿支气管播散的散在高密度结节影及实变影；无发热、咳嗽、咳痰等，门诊给予头孢克肟抗炎治疗 2 周复查 CT 未吸收；查血常规正常，ESR 为 3 mm/1 h，G 试验阴性，乳胶凝集试验阴性，CD3+T 细胞、CD4+T 细胞、CD8+T 细胞正常，痰细菌、真菌培养阴性，风湿免疫及血液系统肿瘤等指标正常。BALF mNGS 结果回报为阴性，作为主诊医师下一步将怎么处理？

A：考虑非感染性疾病，如机化性肺炎；

B：分析 mNGS 原始数据；

C：采用痰 Gene Xpert 和分枝杆菌培养，积极寻找病原微生物；

D：不予处理，临床观察。

正确答案

C

解析：患者职业长期工作于室外，隐匿起病，结合影像学特征高度怀疑结核或非结核分支杆菌可能。分枝杆菌在核酸提取过程中破壁困难，mNGS 对此类病原体的检测敏感度较低，容易假阴性，因此，需要积极寻找其他病原学检测方法。 选择方案 C。

患者转归：患者 T-SPOT 阳性，痰 GeneXpert 阳性，之后痰分枝杆菌培养阳性，经鉴定为结核分枝杆菌。规范抗结核治疗后好转。

场景 3：mNGS 报告出现少见或不熟悉的病原体，应该如何处理？

患者女，65 岁，主因「发热、体重下降伴肺占位性病变 2 个月余」入院。

胸部 CT 及 PET-CT 提示：右肺上叶不规则软组织团块灶伴代谢增高，右侧胸腔积液，双肺多发小结节转移不除外。

既往患系统性红斑狼疮 20 余年，口服激素及免疫抑制剂治疗；2 型糖尿病，胰岛素治疗，血糖控制一般。

入院后查 WBC 正常，NEUT% 为 82. 1%，CRP 为 71.5 mg/L，ESR 为 52 mm/1 h；CA-125 升高，余肿瘤标志物正常。胸腔积液为渗出液，未找见肿瘤细胞，病原学阴性。肺穿刺活检见炎症细胞、组织细胞、多核细胞、上皮细胞，印片及液基内未见恶性依据。

先后给予头孢菌素和左氧氟沙星治疗效果不佳，并出现头痛等症状，头颅增强 MRI 见双侧顶枕部、左侧颞叶多枚强化灶。再行肺穿刺病理检查，镜下肺泡组织、 纤维血管组织及横纹肌组织，部分肺泡腔内见纤维母细胞团，呈机化性肺炎样改变，间质内可见大量急慢性炎症细胞浸润及多核巨细胞反应。

肺组织 mNGS 报告诺卡菌，reads 数 5。该如何解读此患者的 mNGS 结果？

A：明确为诺卡菌感染，给予针对性抗感染治疗；

B：不考虑诺卡菌感染，继续寻找肿瘤证据；

C：可疑诺卡菌感染，加强与微生物实验室沟通，寻求其他病原学证据支持；

D：考虑非感染性病因如机化性肺炎，给予糖皮质激素治疗。

正确答案

C

解析：诺卡菌可存在于积水、植物和土壤中，在免疫缺陷或基础肺部疾病患者中可致病，重者可致播散性感染，与本例患者的临床过程相符，因此即便 reads 数较低，也应引起重视。诺卡菌常规培养易漏检，应以 mNGS 结果为线索，和微生物实验室沟通，寻求其他病原学证据。选择方案 C。

患者转归：经临床微生物学实验室沟通，取合格痰标本先后 2 次培养到诺卡菌，最终明确诊断为播散性诺卡菌病。根据药敏试验以及药物组织穿透性给予复方新诺明、利奈唑胺等联合治疗后病情逐渐好转。