单克隆抗体的制备、纯化与抗体可变区基因测序--如何获得单抗可变区序列（第三部分）

背景介绍

前面两篇文章我们学习了单克隆抗体的制备和从腹水中制备单克隆抗体，但为了满足临床需求，通过腹水准备单抗显然无法满足产量，而一个较好的解决思路是，通过真核细胞重组表达单抗，为了构建稳定表达单抗的细胞株，首先我们就需要知道单克隆抗体的序列（主要是可变区的，恒定区的序列相对保守）。

可变区检测方法

目前有三种方法用法可用于抗体可变区序列的测序，包括PCR法、二步克隆法、以及RACE方法。

其流程都是提取mRNA，反转录得到cDNA，以cDNA为模板进行PCR，最后利用一代测序获得可变区序列。 在这里主要介绍一下克隆法获得可变区序列原理及流程。

一 实验原理简介： 

抗体基因可变区侧翼区的核苷酸序列已经清楚，从已免疫的杂交瘤细胞获得抗体分子抗原结合部位遗传信息的方法是：提取mRNA，反转录生成cDNA，分别用特异性引物经PCR扩增获得VH和VL基因，再经一代测序即可获取抗体可变区序列。

二、实验流程

1、取对数生长期或冻存的杂交瘤细胞1~5 x 10⁶个。

2、用mRNA提取试剂盒提取杂交瘤细胞总mRNA（目前市面上大多数试剂盒都可满足需求）。

3、设计PCR引物

方法一：划线处的酶切位点可以根据实际情况改变

注：对于一套标准引物的设计而言，VH扩增用Bi3f+Bi4，VL扩增用Bi8b+Bi5c；如果这种方法无扩增产物，可进行其他的组合，如Bi3b/3c+Bi4，Bi7+Bi5c。（注意避免扩增产物中有克隆所需的酶切位点）

方法二：划线处的酶切位点可以根据实际情况改变 

4、准备反转录体系：按照M-MuLV Reverse Transcriptase（NEB，M0253S）说明书操作，以mRNA为模板进行反转录，合成cDNA（https://www.neb.cn/zh-cn/protocols/2016/04/26/first-strand-cdna-synthesis-standard-protocol-neb-m0253）。

5、PCR扩增：按照Vent DNA聚合酶或Taq DNA聚合酶使用说明书，加入适当浓度的模板（cDNA）、引物（方法一或方法二）、Mix等，按照推荐的PCR条件进行操作，（PS：一般情况下，根据推荐的条件都能获得阳性结果）。

6、凝胶纯化PCR产物：先对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳验证是否P出阳性结果，如是，则根据凝胶产物纯化试剂盒说明对PCR产物进行回收，以去除DNA聚合酶，防止3’粘性末端被聚合酶的3’→5’的内切酶活性消化。

7 克隆及筛选：用设计引物时选择的内切酶对VH和VL PCR产物进行酶切、回收，连接至测序载体（如T载体），并转化至E.coli，涂板LB抗性平板筛选，挑取单克隆进行扩增、测序。

8、测序结果的比对：将测序结果输入blast进行全局序列比对（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），检测我们获得的PCR产物是否是正确的小鼠/大鼠的免疫球蛋白基因。

9、抗体组装：在基因水平，可通过linker（最常用的结构是具有刚性结构的15肽序列(Gly₄Ser)₃）连接VL的C端和VH的N端，或VH的C端与VL的N端，构成抗体基因或基因片段。

👉至此，我们已经介绍完了单抗从制备到纯化，再到可变区测序的知识，下一章我们将介绍抗体人源化改造原理及实验流程，点个关注期待一下吧！！！

（爱自己！！！做科研!!! 每文格心理学家安东尼 · 罗宾斯说："成功的秘诀就在于懂得怎样控制痛苦和快乐这股力量，而不为这股力量所反制。"如果有用，关注楼主GBhouse，点赞+讨论，攻击性人格请请请不要关注和阅读！！！）