燃爆！nat. commun. | “复旦分型” 领航，邵志敏团队借FLAD1再探三阴性乳腺癌抗癌新

英文标题：Copy number amplification of FLAD1 promotes the progression of triple-negative breast cancer through lipid metabolism

中文标题：FLAD1基因拷贝数扩增通过脂质代谢促进三阴性乳腺癌进展

发表期刊：nature communications

影响因子：14.7

合作单位：复旦大学附属肿瘤医院

百趣提供服务：脂质代谢流、经典脂质组学、脂酰辅酶A高通量靶标代谢组学

文章简介

TNBC存在高拷贝数变异和代谢重编程，治疗手段有限。研究团队分析多组学数据发现，代谢基因FLAD1拷贝数扩增对TNBC进展影响重大。FLAD1经酶依赖途径，通过FLAD1/LSD1/SREBP1信号轴调控脂质代谢，促进TNBC细胞增殖、迁移。临床前实验表明，抑制该信号轴可抑制肿瘤进展，LSD1抑制剂还能增强阿霉素和戈沙妥珠单抗疗效。该研究揭示了TNBC新致癌信号轴，提供了潜在生物标志物和治疗靶点，有望革新TNBC治疗策略。

研究背景

乳腺癌已成为全球女性最常见的癌症，其中三阴性乳腺癌(Triple Negative Breast Cancer, TNBC)占比10-15% ，因其特殊的受体表达情况，预后较差、复发转移率高，目前化疗效果有限，急需新疗法。拷贝数改变(Copy Number Alteration, CNA)和肿瘤代谢是癌症研究重点，已有研究显示相关基因的CNA能影响肿瘤进展，但CNAs调控TNBC代谢重编程的机制尚不明确。

研究结果

1、FLAD1在TNBC中的潜在致癌作用

研究者综合分析了复旦大学附属肿瘤医院(FUSCC)TNBC患者的多组学数据集，从同时拥有拷贝数变异和RNA测序数据的样本中，筛选出在肿瘤组织中频繁扩增且高表达的代谢基因。研究这些基因的CNA值与RNA表达的相关性，发现20个基因的扩增与mRNA表达呈正相关(Pearson r>0.35)。分析对比上述基因在TNBC组织和癌旁组织中的mRNA表达，得到5个候选基因（NDUFB9、SQLE、PYCRL、CYC1和FLAD1）。鉴于已有研究揭示了前4个基因促进肿瘤进展的机制，本研究聚焦位于1q染色体频繁扩增区域的FLAD1进一步研究（图1a）。在FUSCC TNBC队列的原发性TNBC组织中，20.2%的患者存在FLAD1拷贝数扩增，且与mRNA表达正相关。该结果在癌症基因组图谱(TCGA)队列中得到验证（图1b）。原发性TNBC组织中，FLAD1 mRNA表达显著高于相邻的正常组织（图1c），且在T分期和组织学分级较高的样本中表达更高（图 1d）。生存分析显示，在FUSCC TNBC队列和KMPlot数据集中，高FLAD1 mRNA和蛋白表达分别与较差预后相关（图1e）。以上结果表明，在1q21.3基因组位点扩增且在肿瘤中高表达的FLAD1，可能在TNBC的进展中发挥重要作用。

图1.FLAD1在三阴性乳腺癌中高度扩增且与肿瘤进展相关

2、FLAD1促进TNBC细胞增殖和迁移

研究者利用siRNAs在LM2-4175和SUM159细胞中敲低FLAD1，CCK-8检测结果表明，瞬时抑制FLAD1会阻碍细胞增殖。为了进一步证实该发现，研究者使用慢病毒介导的shRNA构建体，在LM2-4175和SUM159细胞中敲低FLAD1（图2a），随后的CCK-8实验和集落形成实验表明，敲低FLAD1显著抑制了细胞增殖和集落形成（图2b-c）。为了研究FLAD1对TNBC细胞迁移能力的影响，进行了transwell实验，发现敲低FLAD1显著减弱了LM2-4175和SUM159细胞的迁移能力（图2d）。

图2.FLAD1促进三阴性乳腺癌细胞增殖和迁移

3、FLAD1对TNBC细胞脂质代谢的影响

研究者将对照组和敲低FLAD1的SUM159细胞进行了转录组测序分析。与对照组相比，在两个独立的通过shRNA敲低FLAD1的SUM159细胞中，分别鉴定出了538个和358个差异表达基因（图3a）。基因集富集分析(GSEA)显示，敲低FLAD1显著抑制了胆固醇和脂肪酸代谢途径（图3b-c）。为了验证上述分析结果，研究者进行了基于液相色谱-质谱联用(LC/MS-MS)的脂质组学分析，敲低FLAD1减少了多种脂质，尤其是胆固醇、脂肪酸和甘油三酯（图3d）。通过高通量分光光度法测量了总胆固醇和甘油三酯，结果表明敲低FLAD1减少了这些物质积累，而WT FLAD1（而非FLAD1-R530C）的过表达增加了细胞内总胆固醇和甘油三酯的积累（图3e-f）。BODIPY中性脂质染色显示，敲低FLAD1降低了SUM159和MDA-MB-453细胞中的中性脂质水平（图 3g），而过表达WT FLAD1（而非FLAD1-R530C）增加了中性脂质水平（图3h），这些发现表明FLAD1是脂质代谢的重要激活剂。

图3.FLAD1促进三阴性乳腺癌细胞的胆固醇和脂肪酸代谢

研究者评估了敲低FLAD1是否会改变参与脂肪酸生物合成(FASN、ACC1 、SCD)、胆固醇生物合成(HMGCR)、脂肪酸摄取(CD36)和脂肪酸氧化(CPT1A)相关基因的表达（图4a-b）。通过RT-qPCR和WB实验，证实在LM2-4175和SUM159细胞中，敲低FLAD1显著降低了参与脂肪酸和胆固醇合成酶的mRNA和蛋白质水平，而CD36和CPT1A的mRNA表达几乎不受影响（图4c和e）。相反，WT FLAD1（而非FLAD1-R530C）过表达显著上调了参与脂肪酸和胆固醇合成酶的mRNA和蛋白质水平，CD36和CPT1A的mRNA表达几乎不受影响（图4d和f）。敲低FLAD1降低了FASN和ACC1的浓度（图4g），过表达WT FLAD1（而非FLAD1-R530C），导致FASN和ACC1浓度增加（图4h），这些发现表明FLAD1调节参与脂质生物合成的基因。SREBP1在控制参与胆固醇和脂肪酸代谢的基因转录中起着关键作用，研究者进一步评估了SREBP1的表达是否受FLAD1的调控。观察到敲低FLAD1导致SREBP1的mRNA和蛋白质表达下降（图4c和e）。相反，过表达WT FLAD1（而非FLAD1-R530C），显著上调了SREBP1的表达（图4d和f）。研究结果表明，SREBP1在FLAD1对脂肪生成酶表达的调控中发挥了关键作用。

图4.FLAD1通过上调脂质生成酶促进三阴性乳腺癌细胞的从头脂肪生成

在对SUM159细胞进行FLAD1敲低处理后，通过靶向代谢组学分析发现，脂肪酸生物合成途径中多种中间产物丰度下降（图5a-b），乙酰辅酶A、丁酰辅酶A、异丁酰辅酶A、油酰辅酶A、棕榈酰辅酶A和丙酰辅酶A等都有所减少，直接表明FLAD1敲低影响了脂肪酸生物合成进程。为进一步探究FLAD1对脂肪酸合成的影响，研究人员开展了[U-¹³C]葡萄糖同位素实验（图5c）。将[U-¹³C]葡萄糖添加到低葡萄糖的DMEM培养基中，培养对照和FLAD1敲低的SUM159细胞24小时后检测发现，FLAD1敲低显著降低了胆固醇和甘油三酯从葡萄糖示踪剂中的标记，这意味着FLAD1在脂肪酸合成过程中发挥关键作用，它的缺失会抑制脂质的从头合成。

图5.敲低FLAD1对脂质代谢的影响

4、FLAD1通过FAD-LSD1信号促进SREBP1表达

LSD1是一种依赖FAD的组蛋白去甲基化酶，能对二甲基化的H3K4或H3K9去甲基化，发挥共激活或共抑制作用（图6a）。研究显示，敲低FLAD1会使H3K4me2和H3K9me2蛋白表达升高（图6b），而WT FLAD1（非FLAD1-R530C）过表达则显著降低其表达（图6c）。基因敲低或药物抑制LSD1，会显著上调H3K4me2和H3K9me2表达，同时在mRNA和蛋白水平抑制脂肪生成基因（图6d-g）。

为验证LSD1对脂肪生成基因的调节依赖SREBP1，研究者构建相关SUM159细胞系（过表达LSD1、敲低SREBP1以及同时过表达LSD1和敲低SREBP1）。结果表明，过表达LSD1上调脂肪生成基因，敲低SREBP1则显著抑制这种上调（图6h）。qRT-PCR和WB分析显示，LSD1抑制剂GSK-LSD1能逆转FLAD1过表达诱导的胆固醇和脂肪酸合成酶mRNA和蛋白水平的增加（图6i-j）。

研究者设计引物覆盖SREBP1转录起始位点附近启动子区域（图6k），ChIP-qPCR分析显示，FLAD1敲低后，SREBP1启动子中H3K9me2（非 H3K4me2）富集显著增加（图6l）；FLAD1过表达降低H3K9me2富集，添加GSK-LSD1可逆转（图6m）。总体而言，FLAD1/LSD1通过H3K9me2去甲基化对部分脂肪生成基因的上调作用，很大程度依赖SREBP1（图6h）。综上，FLAD1通过LSD1介导的H3K9二甲基化去甲基化上调SREBP1表达（图6n）。

图6.FLAD1通过FAD-LSD1信号通路促进SREBP1表达调控脂质代谢

5、FLAD1/LSD1/SREBP1信号轴在TNBC中的治疗潜力验证

由于FLAD1通过LSD1介导H3K9二甲基去甲基化来上调SREBP1表达，研究者探讨了抑制LSD1或SREBP1用于治疗FLAD1过表达的TNBC的可能性。实验显示，FLAD1高表达的对照组对GSK-LSD1或Fatostatin更敏感，用药后细胞生长明显受抑（图7a-b）。在两名FLAD1表达水平不同的TNBC患者类器官中，随着FLAD1表达升高，类器官对GSK-LSD1或Fatostatin的敏感性增强（图7c）。构建TNBC异种移植模型后，敲低FLAD1的小鼠对GSK-LSD1和Fatostatin的敏感性显著下降（图7d-f）。FLAD1/LSD1/SREBP1信号轴在TNBC细胞增殖中起关键作用。

图7.FLAD1/LSD1/SREBP1信号通路是三阴性乳腺癌的治疗靶点

研究结论

研究者针对三阴性乳腺癌展开深入研究，发现FLAD1是驱动三阴性乳腺癌进展的关键调节因子。FLAD1借助LSD1介导的H3K9二甲基去甲基化过程，上调SREBP1的表达。这一分子机制激活后，会进一步促使脂肪酸合成相关基因表达，显著推动TNBC发生细胞增殖、代谢重编程等恶性行为。通过一系列体外细胞实验、患者类器官研究以及体内动物模型验证，充分证实了FLAD1在TNBC发展中的核心作用。因此，FLAD1具备作为TNBC治疗潜在生物标志物的特性，同时也为TNBC治疗提供了全新的治疗靶点。未来，靶向FLAD1/LSD1/SREBP1通路的治疗策略有望打破TNBC治疗困境，为患者带来新的希望，推动TNBC临床治疗的发展与进步。

复旦大学附属肿瘤医院宋效清博士为第一作者，余天剑博士、肖毅副研究员、邵志敏教授为通讯作者。