动物病理切片取材之关键步骤——经心灌注

用以病理染色的样本到底需不需要进行经心灌注后取材？一般来说，经心灌注有两大作用。一是迅速固定组织，尽可能地保留原有的细胞形态和结构；二是排出血管中的红细胞，避免红细胞中血红素的自发荧光效应干扰后续的荧光成像。因此，笔者推荐，用来做病理切片的样本，如有条件，尽可能做经心灌注后取材。以下是操作步骤简述。

先麻醉小鼠，麻醉后将小鼠固定于泡沫箱盖子上（用组织剪戳个洞，用以引流灌注出来的废液至泡沫箱中），暴露小鼠胸腔和心脏（用止血钳固定，用组织剪剪皮和开胸），注意别剪破肝脏和肺脏了，暴露后左手持弯镊稍微用力夹住左心室部（仔细看心尖两侧颜色深浅，较浅那边是左心室部分），然后用头皮针（剪断针尖斜面，以防戳穿心底，提前接上装满生理盐水的注射器并赶走导管中的气泡）从左心耳下缘2 mm处沿着左心室的长轴进针，全神贯注体会手感，当刚好有突破感时再将针推进一点点，这时用直镊将采血针固定。然后用眼科剪剪破右心耳，见暗红的血涌出，接着手推注射器活塞，大概半分钟推完20ml生理盐水，连推2管，这期间观察肝脏颜色、肺脏大小及口鼻有无渗液。灌注成功的判断有以下几点：肝脏在推完40ml生理盐水前逐渐变成桃黄色，肺脏无明显肿大，口鼻无明显渗液。最重要的是看肝脏颜色变化，有时肺脏肿大，口鼻有明显渗液也不一定提示失败。然后是推4%多聚甲醛，40ml，注意观察小鼠的四肢及尾巴有无颤动痉挛，一般灌注得好的话会有明显的上述反应，这是多聚甲刺激神经肌肉的结果。灌完多聚甲后，小鼠身体应该硬成板状。（灌注这一步很关键，直接关系到染色效果，尤其是做免疫荧光，红细胞有自发荧光效应，在488和555激发光下都可以看到明亮的荧光。）

然后取脑，用组织剪从耳后剪下头颅，再在头顶正中剪一刀头皮，把其往两侧剥，这时可以透过菲薄的颅骨看到白色的大脑，修剪枕骨大孔附近的颈部肌肉，改用眼科剪，在枕骨大孔3点和9点钟的位置各剪一刀，然后一手固定头颅，另一手用止血弯钳从枕骨大孔处开始依次撬开枕骨，顶骨，额骨，注意钳子尖端不要向着脑组织，以免损坏皮层，还有留意硬脑膜可能扯裂脑组织，暴露至嗅球时用眼科弯镊从嗅球前下方勾起整个脑组织，离断颅底的脑神经，将脑组织转移至装有多聚甲的EP管中。（这一步各取所需，不是研究脑的可以忽略。） 

笔者有较为丰富的病理染色相关技术与经验，欢迎咨询与交流。