从引物设计到结果-全流程走完实时荧光定量PCR（qPCR）--技术篇

qPCR主要用于mRNA定量，用于测定目的基因表达。下面介绍完整qPCR全流程。

一、 qPCR引物设计

1.查找目的基因转录本序列

以人类TP53基因为例：NCBI gene上查询mRNA序列信息：

下载mRNA序列，并和CDS序列进行比对，找到保守区域序列：

DNAMAN 进行多序列比对：

黑色区域即为保守序列（此序列仅为示例序列），然后跨外显子设计qPCR引物：

二、引物设计原则：

1、原则上遵循普通PCR设计引物原则

2、正反引物的长度应在18 ~ 22个之间；

3、qPCR扩增80 ~250 bp的基因。

三、qPCR

1、实验器具与材料：

（1）移液枪：1ml、200ul、10ul

（2）吸头：1ml、200ul、20ul，无菌枪头即可；

（3） EP管:1.5ml、100ul，无菌EP管即可；

（4）荧光定量PCR仪（Bio-rad CFX96, USA or Roche LightCycler 96 Switzerland）

（5）冰盒（逆转录后cDNA稳定，qPCR酶体系注意冰上操作）

2、qPCR具体步骤：

（1）总RNA提取，既往用Trizol提取步骤繁琐，且Trizol试剂含有毒物质苯酚，对皮肤等组织有腐蚀性和刺激性。此外，酚也具有毒性，对皮肤、粘膜有强烈的腐蚀作用。因此笔者实验室早已弃用Trizol提取总RNA，而是改用总RNA提取试剂盒，一个样品，基本15分钟左右就提取完成，安全快效，试剂盒：RNAfast200。

总RNA提取具体步骤：

1.收集培养细胞：6孔板贴壁细胞胰酶消化后，收集到1.5mL 离心管，总细胞数<2 x 10E6，500g 离心 5-10min，500μL 冷PBS清洗2遍，留存细胞沉淀，最后留约100μL，重悬细胞沉淀。

2.加入RA2液 500μL，充分颠倒混匀5-10次，可用200μL枪头轻轻吹打；静止1min充分裂解。

3.将裂解液吸至配套过滤柱子，13,000 g 离心 1min。

4.离心后弃滤过液，加入500μL洗液，13,000g 离心 1min；共洗2次。

5.完成2次柱子清洗后，13,000g 空离 1-2min。

6.丢弃套管，将柱子移至新的1.5 mL离心管，向过滤膜中央加入30μL左右的洗脱液，室温静置1-2 min。

7.最后，13,000g 离心1 min，获取总RNA，一般可获得500ng/μL的总RNA。

（2）逆转录反应

将获得的总RNA进行逆转录反应，制备后续qPCR模板cDNA。笔者应用Takara PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) （货号：RR047A）

逆转录反应具体步骤：

1.去除基因组DNA：冰上配置反应液，先加入各反应液，对于多个反应，建议配置反应液母液；最后加入总RNA。具体反应体系：

表1 RNA去除gDNA反应体系及反应程序

2.逆转录反应

冰上配置反应液，先加入各反应液，对于多个反应，建议配置反应液母液；具体反应体系：

表2 逆转录反应体系及反应程序

这样，就完成了cDNA的制备。完成制备的cDNA可以直接进行后续qPCR，或者长期-20°C保存。

（3）qPCR反应配置

1. cDNA稀释：

一般所需要的模板量（cDNA）在100ng以下，需将逆转录完成后cDNA按1:5-10比例稀释。如：2ul的cDNA + 18ul Nuclease-Free water。

2. qPCR反应体系的配制

笔者实验室应用BioRad SYBR green Mix：

qPCR扩增10 μl体系成份，根据所加样本的量配制体积的qPCR反应体系。

表3 qPCR反应体系

加样建议：

①每对引物（即内参和目的基因引物）都有一个空白对照（即：不加DNA模板，用Nuclease-Free water代替）；

②每个样本至少3个复孔，可以增加至5个复孔以排除加样误差导致的Ct不一致；

③建议先配置无DNA模板qPCR Mix液。而cDNA模板是在加入qPCR专用的96或者384孔板，每孔单独加入以保证加样的准确性。

④最好选用白色qPCR专用的96或者384孔板进行实验。 

（4） 扩增程序：

表4  qPCR反应程序

GAPDHG作为内参，以threshold cycle (Ct)法进行表达水平的比较，最后计算2^ΔΔCT获得目的基因的表达。

（爱自己！！！做科研!!! 每文格"沉默，并不代表懦弱，是看破不说破的智慧，是洞穿世事的体“我不记得孩童时吃下的饭，但它们，却渐渐的成长为了我的血肉你的骨骼。读书也是一样，你不会完全记得你读过的书，但是它会慢慢塑造你，塑造你的思想、你的灵魂。”"如果有用，关注楼主GBhouse，点赞+讨论，攻击性人格请请请不要关注和阅读！！！）