Day3番外篇之CRISPR-CAS9

CRISPR-Cas9 是一种革命性的基因编辑技术，能够精准地对基因组进行修饰。它源于细菌和古细菌的适应性免疫系统，用于抵御病毒和质粒的入侵。

以下从原理、组成部分、实验步骤、应用和局限性等方面进行详细解释：

1. 基本原理

CRISPR-Cas9系统通过一段向导RNA（sgRNA）引导Cas9核酸酶靶向特定的DNA序列，并在目标位点产生双链断裂（DSB）。细胞通过以下两种机制修复断裂：

• 非同源末端连接（NHEJ）：易出错，导致插入或缺失（indels），可用于基因敲除。
• 同源定向修复（HDR）：利用同源模板精确修复，可用于基因插入或替换。

2. 系统组成

（1）Cas9蛋白

• 功能：核酸酶，负责切割DNA双链。
• 类型：
• 野生型Cas9：产生双链断裂。
• 切口酶Cas9（nCas9）：仅切割一条链，用于降低脱靶效应。
• 失活Cas9（dCas9）：无切割活性，可用于基因调控（如CRISPRi/CRISPRa）。

（2）向导RNA（sgRNA）

• 结构：由CRISPR RNA（crRNA）和反式激活crRNA（tracrRNA）融合而成。
• 功能：通过20个碱基的靶向序列（spacer）与目标DNA互补配对，引导Cas9定位。

（3）PAM序列

• 功能：Cas9识别和结合DNA的必要条件。
• 序列：对于化脓性链球菌Cas9（SpCas9），PAM序列为“NGG”。

3. 实验步骤

（1）目标序列设计

• 选择目标基因区域，设计sgRNA靶向序列（20 bp）。
• 使用在线工具（如CRISPR Design、CHOPCHOP）预测sgRNA效率和脱靶效应。

（2）构建CRISPR载体

• 将sgRNA序列克隆到表达载体中（通常包含Cas9基因）。
• 常用载体：质粒、慢病毒、腺相关病毒（AAV）。

（3）递送系统

• 质粒转染：适用于体外细胞系。
• 病毒转导：适用于原代细胞和体内实验。
• RNP复合物：将Cas9蛋白与sgRNA预组装成核糖核蛋白（RNP），直接递送（高效且低脱靶）。

（4）基因编辑验证

1. 🍱T7E1酶切检测：

• PCR扩增目标区域，变性复性后T7E1酶切错配DNA。
• 通过电泳分析编辑效率。

1. 🍤Sanger测序：

• PCR扩增目标区域，测序分析突变类型。

1. 🍥高通量测序（NGS）：

• 深度测序目标区域，精确评估编辑效率和脱靶效应。

4. 应用领域

（1）基因敲除（Knockout）

• 通过NHEJ引入indels，破坏目标基因功能。
• 应用：研究基因功能、构建疾病模型。

（2）基因敲入（Knockin）

• 通过HDR引入外源序列（如荧光蛋白、突变位点）。
• 应用：基因修复、插入报告基因。

（3）基因调控

• CRISPRi：dCas9与抑制因子（如KRAB）融合，抑制基因表达。
• CRISPRa：dCas9与激活因子（如VP64）融合，增强基因表达。

（4）表观遗传编辑

• dCas9与表观修饰酶（如DNMT3A、TET1）融合，调控DNA甲基化或组蛋白修饰。

（5）基因组筛选

• 使用CRISPR文库（如GeCKO）进行全基因组功能筛选。

（6）疾病治疗

• 基因治疗：修复致病突变（如β-地中海贫血）。
• 癌症治疗：敲除免疫检查点基因（如PD-1）。

5. 在衰老研究中的应用

• 敲除IgG基因：验证IgG在衰老中的作用。
• 编辑衰老相关基因：研究p16、p21等基因的功能。
• 构建衰老模型：通过编辑端粒酶或DNA修复基因模拟衰老表型。

6. 优势与局限性

🍧优势

• 高效：可在多种细胞和生物体中实现基因编辑。
• 精准：通过设计sgRNA靶向特定序列。
• 多功能：可用于基因敲除、敲入、调控和表观遗传修饰。

🧁局限性

• 脱靶效应：sgRNA与非目标序列结合，导致非特异性编辑。
• 递送效率：体内递送仍面临挑战（如免疫反应、组织特异性）。
• HDR效率低：在非分裂细胞中HDR效率较低。

7. 改进技术

（1）高保真Cas9变体

• 如eSpCas9、SpCas9-HF1，降低脱靶效应。

（2）碱基编辑（Base Editing）

• 将Cas9与脱氨酶融合，实现C→T或A→G的碱基转换。

（3）先导编辑（Prime Editing）

• 结合Cas9和逆转录酶，实现任意碱基编辑和小片段插入/删除。

（4）CRISPR-Cas12/Cas13

• Cas12用于DNA编辑，Cas13用于RNA编辑。

8. 示例实验设计

目标：敲除小鼠巨噬细胞中的IgG基因，研究其对衰老的影响。

步骤：

1. 设计靶向IgG基因的sgRNA，构建CRISPR载体。
2. 将载体转染至巨噬细胞，筛选阳性克隆。
3. 通过T7E1和测序验证基因敲除效率。
4. 检测敲除后细胞的衰老表型（如SA-β-gal、p16表达）。