Day3番外篇之免疫组化

免疫组化技术（Immunohistochemistry, IHC） 是一种利用抗原-抗体特异性结合原理，在组织切片中定位和检测特定蛋白质或抗原的空间分布的技术。它结合了形态学观察与分子特异性，广泛应用于病理诊断、疾病机制研究和生物标记物开发。

以下从原理、步骤、关键技术和应用等方面进行详细解释：

1. 基本原理

免疫组化的核心是通过抗体与目标抗原的特异性结合，结合显色或荧光标记系统，在显微镜下可视化目标分子在组织中的定位。其核心步骤包括：

• 抗原-抗体结合：一抗特异性识别目标抗原。
• 信号放大与显色：通过标记的二抗（如酶标或荧光标记）放大信号，并通过化学反应或荧光激发显示目标位置。

2. 实验步骤（以酶标法为例）

（1）样本制备

💛组织固定：

• 新鲜组织迅速固定于4%多聚甲醛（或其他固定液如福尔马林），防止蛋白降解和结构破坏。
• 固定时间需优化（通常6-24小时），避免过度固定导致抗原表位掩蔽。

🩵包埋与切片：

• 固定后组织经梯度脱水（乙醇）、透明（二甲苯），浸蜡后包埋成石蜡块。
• 切片机切取4-5 μm厚切片，贴附于载玻片（需防脱片处理）。
• 冷冻切片：快速冷冻（液氮）后直接切片，适用于易降解抗原（如磷酸化蛋白）。

（2）抗原修复

• 必要性：石蜡包埋过程会掩盖抗原表位，需通过加热或酶处理恢复抗原活性。
• 方法：
• 热修复：切片浸入抗原修复液（如柠檬酸盐缓冲液，pH 6.0），微波或高压加热（95-100℃，10-20分钟）。
• 酶修复：蛋白酶K或胰酶消化（适用于特定抗原）。

（3）阻断与抗体孵育

💙阻断内源性干扰：

• 过氧化物酶阻断：3% H₂O₂处理（抑制内源性过氧化物酶活性）。
• 血清封闭：5% BSA或正常血清封闭非特异性结合位点（10-30分钟）。

💜一抗孵育：

• 滴加稀释的一抗（如抗IgG抗体），湿盒中4℃过夜或室温孵育1-2小时。
• 稀释度优化：需预实验确定最佳浓度（减少背景信号）。

💚二抗孵育：

• 滴加酶标二抗（如HRP标记的抗兔IgG），室温孵育30-60分钟。

（4）显色与复染

1. 显色反应：

• DAB（3,3'-二氨基联苯胺）显色：HRP催化DAB生成棕色沉淀（需显微镜下控制显色时间）。
• AEC（3-氨基-9-乙基咔唑）：生成红色沉淀（水溶性，需水性封片剂）。

1. 复染：

• 苏木素（Hematoxylin）复染细胞核（蓝色），增强组织结构的对比度。

（5）封片与观察

• 脱水透明：梯度乙醇脱水，二甲苯透明。
• 中性树胶封片，光学显微镜观察并拍照。

3. 关键技术及注意事项

（1）抗体选择与验证

• 一抗特异性：需验证抗体在目标物种中的交叉反应性（如抗人IgG是否与小鼠IgG交叉）。
• 阳性/阴性对照：
• 阳性对照：已知表达目标抗原的组织。
• 阴性对照：省略一抗或用同型IgG替代。

（2）抗原修复优化

• 不同抗原需选择最佳修复方法（热修复vs.酶修复，pH值调整）。

（3）信号与背景平衡

• 减少非特异性结合：优化封闭剂（如BSA、血清种类）、洗涤次数（PBST充分洗涤）。
• 显色时间控制：避免过显色导致背景过高。

（4）定量分析

• 半定量评分：根据染色强度（0-3分）和阳性细胞比例（0-100%）综合评分。
• 图像分析软件：如ImageJ、QuPath等，可定量染色面积和强度。

4. 免疫组化类型扩展

1. 直接法：一抗直接标记酶或荧光素（步骤少，但灵敏度低）。
2. 间接法：二抗携带标记物（信号放大，灵敏度高）。
3. 荧光免疫组化（IF/IHC-F）：

• 使用荧光标记二抗（如FITC、Cy3），共聚焦显微镜观察。
• 优势：多色标记（同时检测多个抗原），高分辨率。

5. 在衰老研究中的应用

• 定位IgG积累：通过抗IgG抗体染色，明确IgG在衰老敏感点（SSSs）周围微环境中的空间分布。
• 与组织结构熵关联：结合H&E染色观察组织形态，分析IgG聚集区域与组织结构紊乱的相关性。
• 验证机制：检测IgG诱导的巨噬细胞衰老标志物（如p16、SA-β-gal）在组织中的表达定位。

6. 局限性及解决方案

• 抗原损失：石蜡包埋可能破坏某些抗原，优先选择冷冻切片或优化修复条件。
• 背景信号：严格设置对照，优化抗体浓度和封闭条件。
• 定量困难：结合数字化病理和AI分析提高客观性。

7. 示例实验设计

目标：验证老年小鼠肝脏中IgG的积累及其与巨噬细胞浸润的关系。

步骤：

1. 取年轻和老年小鼠肝脏石蜡切片，进行抗IgG和抗F4/80（巨噬细胞标记）双染色。
2. DAB显色（IgG，棕色）与AEC显色（巨噬细胞，红色），苏木素复染。
3. 显微镜下分析IgG沉积区域与巨噬细胞浸润的空间共定位。