mRNA生产：（1）mRNA序列设计

mRNA的生产通常包含了mRNA序列设计，DNA模板生产，体外转录（in vitro transcription，IVT）和脂质纳米颗粒包载（lipid nanoparticle formulation，LNP）几个步骤。在mRNA生产系列文章中将详细介绍这几个步骤，包括实验过程中需要注意的问题以及涉及到的质量控制（quality control，QC）。本章将介绍mRNA序列设计相关内容。

一个mRNA序列会编码以下几个组件：启动子（promoter），5‘端非翻译区（5‘UTR），3‘端非翻译区（3’UTR），开放阅读框（open reading frame，ORF）和多聚核苷酸尾（poly(A) tail）。

启动子序列与噬菌体RNA聚合酶结合来启动mRNA体外转录。我们通常使用T7聚合酶，其他常用启动子还有SP6和T3聚合酶。如果使用共转录加帽，加入修饰过的转录起始二核苷酸（AG）会利于5端帽类似物的结合。

ORF两侧是影响mRNA翻译和稳定性的非翻译区（UTRs）。5‘UTR影响翻译起始，而3‘UTR则有更强的细胞特异性调节力。大多数高表达基因和mRNA疫苗都有较短的5‘UTR，翻译起始位点周围很少有二级结构，并且起始密码子之前有共有的Kozak序列。我们通常选择来自目标生物体管家基因中短的非结构化的UTR来提供较强的表达。比如，alpha珠蛋白和beta珠蛋白UTRs。alpha珠蛋白5‘UTR可以促进在大多数哺乳动物的细胞和动物中的蛋白组成性高表达。

初始mRNA的3‘UTR通常包含结合细胞蛋白的调控序列，并可以调节mRNA稳定性。通过修饰3‘UTR序列，可以去除降低mRNA稳定性的microRNA结合序列。与5‘UTR类似，常用的3‘UTR如alpha珠蛋白来自高表达的稳定mRNA，其长度较短且比较稳定。如需优化在非哺乳动物细胞（如昆虫细胞培养、植物、斑马鱼等）中组成性表达的mRNA，我们同样建议选择来自高表达的且稳定的管家基因中的较短的5’UTR和3‘UTR序列。选择UTR的另一个考虑因素是细胞类型特异性UTR可能会在靶细胞中选择性表达。

Poly(A)尾在mRNA翻译中起着关键作用。较长的poly(A)尾与mRNA稳定性相关。其他可供选择的Poly(A)尾，如分段的、修饰的或者分支的序列均被证实可提高mRNA稳定性和表达。

mRNA序列需要用常用密码子替代稀有密码子来进行密码子优化（codon optimisation）。密码子优化可以确保后续翻译不会受到可用tRNA的阻碍。为了减少固有免疫反应的激活，序列还需要去除尿苷残基和双链二级结构。

关于mRNA序列设计相关软件的使用，可查阅我之前发表的帖子。