类器官小鼠小肠原代培养实验步骤

一、实验准备

实验动物：选择6-8周龄健康的C57BL/6小鼠，购自正规实验动物供应商，并在标准动物房环境中饲养3天以上，适应环境后用于实验。

二、主要试剂与耗材：

- 无菌PBS缓冲液、含双抗（青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL）的DMEM/F12培养基、Advanced DMEM/F12培养基、Matrigel基质胶、Dispase II酶、70%乙醇、TrypLE Express酶、R-spondin1、Noggin、EGF、N-2 Supplement、B-27 Supplement、Y-27632（ROCK抑制剂）、1.5mL离心管、24孔板、100μm细胞筛网、镊子、剪刀、眼科剪、眼科镊、无菌培养皿、移液器及枪头。

三、仪器设备：

- 超净工作台、CO₂培养箱（37℃、5%CO₂）、离心机、倒置显微镜、电子天平、低温冰箱（-20℃、-80℃）、液氮罐。

四、实验步骤

小鼠处理：

1.- 将小鼠置于超净工作台内，用70%乙醇棉球对小鼠全身进行擦拭消毒，尤其是腹部区域。

2.- 使用颈椎脱臼法迅速处死小鼠，确保小鼠无痛苦且快速死亡，避免对肠道组织造成不必要的损伤。

小肠组织获取：

1.- 用镊子和剪刀迅速打开小鼠腹腔，小心分离出小肠组织，从小肠起始端（十二指肠）至末端（回肠）完整取出，尽量避免损伤肠系膜血管和肠道组织。

2.- 将取出的小肠组织放入盛有预冷的含双抗的PBS缓冲液的无菌培养皿中，轻轻漂洗，去除表面的血液和其他杂质。

小肠组织清洗与剪碎：

1.- 将漂洗后的小肠组织转移至新的无菌培养皿中，加入适量预冷的PBS缓冲液，用眼科镊和眼科剪去除小肠表面的脂肪和系膜组织。

2.- 用PBS缓冲液再次冲洗小肠组织3-4次，每次冲洗后用移液器吸去上清液，直至冲洗液清澈无杂质。

3.- 将清洗干净的小肠组织剪成约1cm长的小段，放入新的无菌培养皿中备用。

隐窝分离：

1.- 在装有小肠小段的培养皿中加入适量Dispase II酶（浓度为2.5mg/mL），确保小肠组织完全浸没在酶液中。

2.- 将培养皿置于37℃恒温摇床中，以80-100rpm的速度振荡消化20-30分钟。期间每隔5-10分钟在显微镜下观察消化情况，当小肠组织边缘出现模糊、绒毛脱落时，表明消化基本完成。

3.- 消化结束后，用移液器将酶液和小肠组织转移至1.5mL离心管中，300g离心5分钟，弃去上清液。

4.- 加入适量预冷的PBS缓冲液，轻轻吹打重悬沉淀，再次300g离心5分钟，弃去上清液，重复清洗2-3次，以去除残留的酶液。

5.- 加入适量含双抗的DMEM/F12培养基，用移液器轻轻吹打，使小肠组织分散成单细胞悬液。

6.- 将单细胞悬液通过100μm细胞筛网过滤至新的离心管中，去除未消化的组织块和较大的细胞团。

7.- 300g离心5分钟，弃去上清液，收集沉淀，即为分离得到的小肠隐窝细胞。

细胞计数与活力检测：

1.- 用移液器吸取适量的小肠隐窝细胞悬液，加入等体积的台盼蓝染液，轻轻混匀，染色3-5分钟。

2.- 取少量染色后的细胞悬液滴加到血细胞计数板上，在显微镜下计数活细胞（未被染成蓝色）和死细胞（被染成蓝色）的数量，计算细胞活力。细胞活力（%）=（活细胞数÷总细胞数）×100%，要求细胞活力达到85%以上。

Matrigel包被与细胞接种：

1- 将Matrigel基质胶从-80℃冰箱取出，置于冰盒上缓慢融化，避免温度过高导致基质胶凝固。

2- 在冰上操作，将融化后的Matrigel基质胶加入到24孔板中，每孔加入50μL，轻轻晃动孔板，使Matrigel均匀覆盖孔底，然后将24孔板放入37℃CO₂培养箱中孵育30-60分钟，使Matrigel凝固。

3- 根据细胞计数结果，用Advanced DMEM/F12培养基将小肠隐窝细胞稀释至合适的密度（一般为1×10⁵ - 5×10⁵个/mL），并加入R-spondin1（500ng/mL）、Noggin（100ng/mL）、EGF（50ng/mL）、N-2 Supplement（1×）、B-27 Supplement（1×）、Y-27632（10μM）等生长因子和添加剂，轻轻混匀。

4- 从培养箱中取出24孔板，将稀释好的细胞悬液每孔加入50μL，小心滴加在Matrigel表面，避免产生气泡。然后将24孔板轻轻放回培养箱中，静置15-20分钟，使细胞贴附在Matrigel上。

5- 待细胞贴附后，每孔缓慢加入500μL含上述生长因子和添加剂的Advanced DMEM/F12培养基，注意不要冲散细胞。

类器官培养与观察：

1- 将24孔板放入37℃、5%CO₂培养箱中培养，每隔2-3天更换一次培养基。在更换培养基时，用移液器轻轻吸去旧培养基，注意不要吸到Matrigel和细胞，然后缓慢加入新鲜培养基。

2- 每天在倒置显微镜下观察类器官的生长情况，记录类器官的形态、大小、数量等变化。一般在培养2-3天后，可观察到小肠隐窝细胞开始增殖形成类器官，呈圆形或椭圆形的囊泡状结构，内部含有空腔。随着培养时间的延长，类器官会不断增大并分化出不同的细胞类型，如肠上皮细胞、杯状细胞等。

类器官传代：

1- 当类器官生长至一定大小（直径约100-200μm）且数量较多时，需要进行传代培养，以扩大培养规模。

2- 吸去24孔板中的培养基，用PBS缓冲液轻轻冲洗2-3次，去除残留的培养基和杂质。

3- 每孔加入100μL TrypLE Express酶，将24孔板放入37℃培养箱中孵育5-10分钟，期间在显微镜下观察，当类器官开始脱离Matrigel时，表明消化基本完成。

4- 加入等体积的含10%FBS的Advanced DMEM/F12培养基终止消化，用移液器轻轻吹打，将类器官吹散成单细胞或小细胞团。

5- 将细胞悬液转移至1.5mL离心管中，300g离心5分钟，弃去上清液。

6- 用适量的Advanced DMEM/F12培养基重悬沉淀，按照上述Matrigel包被与细胞接种的方法，将细胞接种到新的24孔板中进行传代培养。

注意事项

1、实验操作全程需在无菌条件下进行：避免微生物污染，所有试剂、耗材均需经过严格的灭菌处理，实验人员需穿戴无菌工作服、口罩和手套，超净工作台需提前开启紫外灯照射30分钟以上进行消毒。

2、Matrigel基质胶使用注意事项：Matrigel对温度敏感，融化和操作过程需在冰上进行，避免在室温下放置时间过长导致凝固。使用前需充分混匀，但要避免剧烈振荡产生气泡。

3、细胞消化时间的控制：在隐窝分离和类器官传代过程中，消化时间要严格控制，时间过短可能导致细胞分离不完全，时间过长则会损伤细胞，影响类器官的生长和分化。

4、生长因子和添加剂的保存与使用：R-spondin1、Noggin、EGF等生长因子和添加剂需按照说明书要求保存，一般保存在-20℃或-80℃冰箱中。使用时需现用现配，避免反复冻融导致活性降低。

5、类器官培养过程中的观察与记录：每天要定期观察类器官的生长情况，及时发现并处理可能出现的问题，如污染、细胞生长异常等。同时，要做好详细的实验记录，包括实验日期、操作步骤、观察结果等，以便后续分析和总结。