肺纤维化疾病造模步骤

实验动物选择与准备

1.动物选择：优先选用6 - 8周龄、体重20 - 25g的SPF级C57BL/6小鼠，这类小鼠遗传背景清晰、免疫反应均一，对造模刺激反应稳定 ，能保证实验结果的可靠性和重复性。

2.动物适应性饲养：小鼠购入后，在温度（22±2）℃、相对湿度（50±5）%、12小时光照/黑暗交替的环境中适应性饲养1周。期间自由摄食和饮水，让小鼠适应实验室环境，减少环境应激对实验结果的干扰。

3.试剂与器材准备

主要试剂：博来霉素（Bleomycin）、戊巴比妥钠、无菌生理盐水、碘伏、75%酒精。博来霉素是诱导肺纤维化的常用药物，需根据实验需求准确计算用量，用无菌生理盐水现配现用，避免药物失活；戊巴比妥钠用于小鼠麻醉，需精确称取并配制成合适浓度的溶液。

器材：微量注射器（100μL）、动物手术器械一套（镊子、剪刀、手术刀等）、超声雾化器、小动物肺功能检测仪、电子天平、石蜡切片机、苏木精 - 伊红（HE）染色试剂盒、Masson染色试剂盒、免疫组化试剂盒、荧光定量PCR仪、蛋白免疫印迹（Western Blot）相关试剂和设备。

造模方法

1.气管内滴注法

（1）小鼠麻醉：称取小鼠体重，按30 - 50mg/kg的剂量腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液。注射后密切观察小鼠反应，当小鼠角膜反射消失、四肢肌肉松弛，表明麻醉成功。

（2）体位固定：将麻醉后的小鼠仰卧位固定于手术台上，用胶带固定四肢，头颈部稍向后仰，充分暴露颈部气管。

（3）气管暴露：用碘伏和75%酒精依次消毒颈部皮肤，沿颈部正中纵向切开皮肤约1 - 1.5cm，钝性分离皮下组织和肌肉，暴露气管。操作过程中动作轻柔，避免损伤气管周围血管和神经。

（4）药物滴注：用微量注射器抽取适量含博来霉素（5 - 7mg/kg，以生理盐水稀释至50 - 100μL）的溶液，将针头斜面向上，小心插入气管内，缓慢匀速注入药物。注药过程中密切观察小鼠呼吸，避免药物误注入食管或引起呛咳。注药完毕后，立即将小鼠直立并旋转，使药物均匀分布于肺部。

（5）伤口处理：用碘伏消毒伤口，用丝线缝合皮肤，将小鼠放回饲养笼，保持温暖、安静，密切观察小鼠苏醒和恢复情况。

2.雾化吸入法

（1）雾化装置准备：将超声雾化器的雾化杯洗净、消毒，加入含博来霉素（浓度为1 - 2mg/mL，以生理盐水配制）的溶液2 - 3mL。调节雾化器参数，使雾化颗粒直径在1 - 5μm，保证药物能有效到达小鼠肺泡。

（2）小鼠固定：将小鼠放入特制的有机玻璃雾化舱内，雾化舱需保持良好的密封性和通风性。

（3）雾化吸入：开启雾化器，让小鼠持续吸入雾化药物30 - 45分钟，每天1次，连续7 - 14天。吸入过程中密切观察小鼠呼吸、活动状态，避免小鼠因应激或缺氧出现意外。

模型评价

1.大体观察：造模后定期观察小鼠外观、精神状态、饮食、体重变化。正常小鼠毛色光亮、活动自如、饮食正常；肺纤维化小鼠逐渐出现毛发枯黄、精神萎靡、活动减少、饮食下降、体重减轻等症状，随着病情进展，可出现呼吸困难、呼吸频率加快、鼻翼扇动等表现。

2.肺功能检测：在造模后第7天、14天、28天等时间点，使用小动物肺功能检测仪检测小鼠肺功能。将小鼠放入体积描记箱，适应5 - 10分钟后，检测潮气量（VT）、呼吸频率（RR）、每分钟通气量（MV）、肺顺应性（CL）等指标。肺纤维化小鼠表现为VT减小、RR加快、MV降低、CL下降，反映肺通气功能障碍和肺顺应性降低。

3.组织病理学检查：

- 取材：在预定时间点处死小鼠，用过量戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，打开胸腔，经右心室灌注生理盐水，直至流出液体清亮，以清除肺内血液。然后完整取出肺组织，用生理盐水冲洗表面，滤纸吸干水分。

- 固定与包埋：将左肺组织放入4%多聚甲醛溶液中固定24 - 48小时，然后依次经梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，制成石蜡切片（厚度4 - 5μm）。

- 染色与观察：分别进行HE染色和Masson染色。HE染色可观察肺组织的病理形态学变化，正常肺组织肺泡结构清晰，肺泡壁薄，无炎症细胞浸润；肺纤维化小鼠肺泡结构破坏，肺泡间隔增厚，有大量炎症细胞浸润，后期可见纤维组织增生和胶原沉积。Masson染色可特异性显示胶原纤维，正常肺组织胶原纤维含量少，呈淡蓝色；肺纤维化组织中胶原纤维大量增生，呈蓝色，可直观评估肺纤维化程度。

4.分子生物学检测：

- mRNA水平检测：提取右肺组织总RNA，反转录为cDNA，采用荧光定量PCR检测相关基因表达，如α - 平滑肌肌动蛋白（α - SMA）、Ⅰ型胶原蛋白（Col1α1）、转化生长因子 - β1（TGF - β1）等。肺纤维化小鼠这些基因表达显著上调，反映成纤维细胞活化、胶原合成增加和纤维化相关信号通路激活。

- 蛋白水平检测：提取肺组织总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，通过Western Blot检测上述基因对应的蛋白表达水平，结果与mRNA水平变化趋势一致，进一步验证肺纤维化模型的成功构建。