THP-1慢病毒感染步骤（CRISPR-Cas9体系）

1.实验目的：THP-1慢病毒感染（CRISPR-Cas9体系，两步法）。第一步，LentiCas9慢病毒感染，让WT THP-1表达Cas9蛋白，通过Blasticidin（BSD）加压筛选；第二步，LentiGuide慢病毒感染，让THP-1（表达Cas9）表达sgRNA，通过Puromycin（Puro）加压筛选，从而得到目的基因敲除的THP-1 KO细胞株。

2.实验结果：得到表达Cas9的THP-1工具株；得到目的基因敲除的THP-1 KO细胞株。如果想要得到目的基因全敲的THP-1 KO细胞株，需要进行单细胞克隆培养与鉴定，而单纯通过BSD + Puro筛选得到的细胞株是KO细胞、表达sgRNA的细胞、表达Cas9的细胞、WT细胞的混合株，良好的加压策略可以尽量提高KO细胞的比例，但不是严格意义上的全敲细胞株。

3.准备：

（1）WT THP-1：状态良好的细胞株是后续所有感染实验的基础。细胞状态不佳时，感染效率低下（THP-1培养见前文）。一切实验都建立在细胞状态良好的基础上！细胞状态不佳的时候，要么尽力调整，要么重新复苏，不要进行感染以及后续实验。

（2）慢病毒：eGFP慢病毒（用于滴定最佳MOI），LentiCas9慢病毒（用于表达Cas9蛋白），LentiGuide慢病毒（用于表达sgRNA）均为公司构建。

（3）Polybrene、Blasticidin、Puromycin，购于MCE及Selleck。

4.步骤：

（1）MOI滴定：确定最佳MOI（设定MOI梯度10/20/30/40）。24孔板，每孔30万细胞（密度约50%），polybrene = 5μg/mL。计算方法：30万细胞，MOI=10时，需要病毒数300万，若公司交付的病毒滴度为3*10e7/mL，所以需要病毒液300万/滴度=100μL。每孔为600μL体系（包括病毒液、Polybrene、细胞悬液，剩余体积用完全培养基补齐）；12小时后加完全培养基600μL。24h后换完全培养基1.2mL/孔。

eGFP慢病毒转染后，每24h在荧光显微镜下观察荧光表达情况。我的实验数据为细胞在第4天开始表达绿色荧光，MOI=20时可达到较好的表达效果（优于MOI = 10，不亚于MOI = 30/40），在不加压筛选的情况下，第10天表达绿色荧光的细胞占比超过50%，所以选定MOI = 20作为后续转染参考值。

（2）Blasticidin剂量滴定：WT THP-1（严格说这里应该用LentiCas9的对照慢病毒感染的细胞来滴定），12孔板，60万细胞/孔（密度约50%），BSD剂量设置为2/4/6/8/10μg/mL，培养基1mL/well，每天换液，取第4天（96h）可杀死全部细胞的最低剂量。我的实验结果为4μg/mL。

（3）LentiCas9慢病毒感染：24孔板，30万细胞（密度约50%），600μL体系（包括病毒液、Polybrene、细胞悬液，剩余体积用完全培养基补齐）。12小时后加完全培养基600μL。24h后换完全培养基1.5mL。

（4）Cas9 THP-1细胞株加压筛选：细胞感染LentiCas9慢病毒后，若细胞状态良好，在第6-7天开始进行加压，BSD 2μg/mL维持48h，BSD 4μg/mL维持96h，6天为一个周期。注意，BSD和Puro加入后，在24h-48h开始起到杀灭细胞的效果，停药后可维持大概48h。第一次感染后，需要筛3-4轮，才能得到较高的目的细胞比例。以后可用BSD 2μg/mL维持，在进行细胞干预实验前，根据细胞死亡情况再筛1-2轮即可。

（5）Puromycin剂量滴定：THP-1 Cas9细胞株，12孔板，60万细胞/孔（密度约50%），Puro剂量设置为1/2/3/4/5μg/mL，培养基1mL/well，每天换液，取第4天（96h）可杀死全部细胞的最低剂量。我的实验结果为2μg/mL。

（6）sgRNA-慢病毒感染：同（3）。

（7）KO细胞加压筛选：细胞感染LentiGuide慢病毒后，若细胞状态良好，在第6-7天开始进行加压，BSD 2μg/mL + Puro 1μg/mL维持48h，BSD 4μg/mL + Puro 2μg/mL维持96h，6天为一个周期。第一次感染后，需要筛3-4轮，然后可用BSD 2μg/mL + Puro 1μg/mL维持，在进行细胞干预实验前，根据细胞死亡情况再筛1-2轮即可。

5.其他：

（1）不论是最佳MOI、各种抗生素的剂量，都是会因为细胞状态、实验条件而改变的，他人数据仅供参考。

（2）关于细胞感染后换液时机：由于THP-1是悬浮细胞，在病毒感染后需要换液时，我是待细胞沉底后直接吸取上清换液，重复3次以尽量弃掉含有病毒的培养基。同时，考虑到THP-1具有一定的密度依赖性，我一般会感染2个或4个孔，这样换液的时候如果细胞状态不佳、数量少，可以合二为一，保证细胞密度。

（3）关于细胞感染后加压时机：我的eGFP表达是从第4天开始的，所以我在感染慢病毒之后第6-7天开始加压筛选，一方面为了保证细胞的数量和状态，一方面也让抗生素抗性基因有充分的时间表达。之前也有考虑过，如果转染效率不高，抗性细胞比例少，在细胞增殖的过程中无抗性细胞可能越来越多，所以我采用了递增加压的方式，让无抗性细胞逐渐死亡，恢复抗性细胞比例。

（4）理论上说，每次慢病毒感染前，由于THP-1细胞状态改变，都需要重新滴定MOI和相应抗生素加压浓度。但实际上，我个人观点是，只要细胞状态够好，同一个实验体系下就一定会有一定比例的细胞被感染，熬过逐步加压后就能得到目的细胞。所以，归根结底，良好的细胞状态 + 稳定的筛选培养体系 = 好的敲除效率。