菌液PCR基本原理及实践操作

GBhouse

发布于 2024-12-15 · 浏览 2224 · IP 陕西陕西

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1 背景介绍

1.1 应用背景

菌落/液PCR (Colony PCR)是一种基于扩增微生物（如大肠杆菌工程菌等）中重组DNA片段的技术。该技术能够快速、高效的复制目的片段DNA，在在微生物学和生物医学研究中被广泛的使用，能够帮助科研人员快速获得目的DNA片段序列，利于进一步分析和研究[1-4]。

（图1 构建重组质粒示意图[8]）

1.2 基本原理

菌落/液PCR (Colony PCR)：基于重组目的片段的PCR体外扩增，从而实现目的片段的鉴定。常规的PCR扩增需要特定的DNA片段，例如在重组菌液中，需要进行细菌培养、质粒提取等繁琐步骤（这些繁琐步骤会导致DNA片段丢失较大）后方能进行特定片段的扩增。而菌落PCR能够直接以单个菌落为模板，快速鉴定菌落是否携带目的片段。因此，菌落PCR是一种能够快速鉴定重组质粒是否携带目的片段的常用手段，具备操作简单、高效和阳性率较高等优点，经常用于转化后，测序前、扩培前的目的片段鉴定[5-7]。

（图2 PCR快速鉴定目的片段示意图）

2 菌落PCR

2.1 菌落PCR引物选择

针对重组质粒的PCR因为选择可根据实验目（过表达/敲入/敲低/敲除）的而定，一般情况如下：

（图3 不同引物特异扩增片段示意图[3]）

（1）载体特异性引物：载体特异性引物是通用引物，能够特异性检测插入到质粒中的目的片段；

（2）扩增特异引物：一般用于整个片段（较长）的敲入、过表达（稳定/瞬时）等较短的引物；

（3）定向特异引物：一般用于平末端克隆。

表1 不同引物的优点与缺点

2.2 单克隆样品制备

单克隆样品的制备，是重组质粒转化后的阳性克隆菌落菌落测序前或扩培前的快速鉴定（最终以测序结果为准），那么单克隆菌落样品制备主要包含一下几步：

（1）挑取单克隆：将LB固定细菌培养板，画出若干个象限（3/4/6/8等），每个象限挑取一个单克隆菌落；

（2）单克隆菌液：将单克隆菌落使用白色枪头转移至20 μL EP管中，使用含有对应抗生素的10μL LB等液体培养基，将菌落稀释，取1-2 μL菌落PCR作为模板，剩下的8-9μL菌液转移至500 μL LB（含抗生素）液体培养基中进行扩培（37℃，220-250 rpm）。

注意事项：1、严格无菌操作；2、防止菌落培养时间过长（会因抗生素耗竭长出杂菌和卫星菌落，一般控制到48H内完成）、3、做好阴性对照。

（图4 单克隆菌落样品制备）

2.3 菌落/液PCR

菌落PCR反应能够破坏菌本身结构（热解释菌种的DNA 质粒），从而扩增重组质粒中含有的目的片段，以达到鉴定特定片段的目的。具体操作步骤如下：

（1）配制PCR反应液

菌落PCR缓冲液与普通DNA模板的反应缓冲液一样，只是菌落PCR添加的模板使用的是菌落稀释后的菌液，具体配制房间建表2：

表2 菌液PCR反应液配制（10 μL）

（2）菌落PCR反应

菌落PCR反应在PCR反应仪器中进行，根据Taq聚合酶的说明书、引物Tm值和目的片段设置反应条件

（图5 菌液PCR反应制备及反应过程示意图）

3 琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳能够用于鉴定获得的DNA/RNA片段最常用或者标准方法。琼脂糖源于琼脂中提取的一种多糖，它具亲水性、不带电荷（电中性），是一种很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下（碱性缓冲液（TBE、TAE和MOPS））带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率也不同。溴化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。（备注TAE成本低，但效率不如TBE，MOPS常用语RNA）

将样品根据标记进行点样，然后设置电泳槽参数（3-5V/cm，具体可根据实验不同电泳槽设定特定的参数）。

4 菌落PCR后续实验

菌落PCR具备操作简单、高效和阳性率较高等优点，经常用于转化后，测序前、扩培前的目的片段鉴定。因此，确定阳性克隆后，直接将对应的菌液PCR进行扩培+送测，这样就为实验节省了大量时间的同时也减少了实验的成本投入。

5 注意事项

（1）无菌环境：实验过程中的EP管、枪头、超净台、移液器等需要进行杀菌处理，并在无菌环境中进行相关实验；

（2）挑取单克隆：挑取单克隆在超净台中进行，且应该挑取单菌落，大小合适，且无卫星菌落或其他杂菌污染；

（3）必要的对照：在进行菌液PCR时候，必须设定阴性对照（ddH₂O），如有必要可设置阳性对照（获得目的片段等），当电泳条带不正确时候可找到可能的潜在因素，避免盲目重复实验来寻找原因；

（4）探究合适的反应条件：一般情况下，根据早期制备重组质粒时候，抓取靶基因时候的反应条件即可；

（5）合适的菌液体积：一般情况下，2-3mm菌落使用10μL稀释后，取其中1-2μL即可，不要取太多，不然电泳后拖带很严重，不利于判断最终结果；

（6）实验过程注意安全：由于实验过程存在致癌试剂（EB等），遗传物质变异因素（EB、紫外线）实验过程中严格穿戴实验服、手套护目镜等，保障自身安全。

6 结束。

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