超级感受态 Super Competent Cells 基本原理及制备实操
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1 背景知识介绍
1.1 Stbl3工作原理
Stbl3超级感受态细胞（Stbl3 Super Competent Cells）菌株源于HB101 E. coli，基于其携带重组酶recA13，具备抑制长片段末端重复区重组的能力[1]，降低错误重组的概率。菌株设计用于克隆慢病毒表达载体中的正向重复序列，这些细胞能降低 ViraPowerTM 慢病毒和其它逆转录病毒载体中长末端重复 (LTR) 的有害同源重组频率[2]。但不含核酸酶endA1突变，体内核酸酶含量较高，提取质粒时必需使用质粒提取试剂盒中去除蛋白液 [3]。
1.2 stbl3用途
Stbl3菌株与常见的大肠杆菌相比（例如DH5α），非常稳定，适用于慢病毒载体等较大质粒或其它不稳定载体的转化效率以及克隆和扩增的稳定性有显著提高[1,4-5]。但这些慢病毒质粒较大，以及Stbl3菌株自身属性，在单克隆的数量上显著性降低。
2 stbl3制备
2.1 试剂材料
试剂：Stbl3菌株、二甲基亚砜（DMSO）、PIPES（2乙磺酸）（不溶于水，溶于NaOH溶液）、inoue缓冲液（最后滴加PIPES）、SOB培养基（配方见表1）、LB培养基（需要提前1天制备）；
耗材：细菌培养皿、枪头（1ml、200μL和20μL）、1.5 ml EP、锥形瓶（250 ml）4个（需要提前1天制备）。
表1 Inoue缓冲液（1X）配制[7-8]
3 Stbl3超级感受态制备
3.1 Stbl3单克隆菌落及扩培
（1）挑取Stbl3单克隆：将Stbl3复苏后，涂布至LB固体培养皿，经SOB培养在37℃ 培养 16-20 h 后挑取单菌落 ( 2-3 mm直径)；
（2）菌落培养：将菌液转移至1.5 mL EP（含1 mLSOB培养基）管中，于37℃，250-300 rpm培养4h左右；
（3）菌液扩培：将1.5 mL EP菌液分成4等份转移至250 mL 锥形瓶中，于37℃，250-300 rpm培养12-16h左右（或当天下午6点开始培养，培养过夜）；
（4）测定菌液OD600：于第二天早晨（6点）测定菌液OD600数值，每隔45 min测定一次，当OD600 = 0.55时，终止培养并冰浴10 min。
3.2 Stbl3超级感受态制备流程
（1）离心收集Stbl3沉淀：将上述菌液转移至离心瓶中，使用2500 g离心10 min，收集Stbl3沉淀；
（2）预冷Inoue重悬细菌沉淀：每个离心瓶的Stbl3沉淀使用100 ml预冷的Inoue轻柔重分重悬（轻轻旋转，不要震荡和吹吸重悬）；
（3）离心收集Stbl3沉淀：将（2）重悬Stbl3菌液转移至离心瓶中使用2500 g离心10 min，收集Stbl3沉淀；
（4）彻底清除培养基：将上述盛有Stbl3沉淀的离心瓶倒扣，并使用真空吸引器吸取壁上残留的液体（也可使用高压灭菌的吸水纸将残留液体清除）；
3.3 Stbl3高级感受态分装于冻存
（1）冻存液配制：在预冷的100 mL Inoue中加入7.5 mL DMSO重分混匀，并冰浴10 min备用；
（2）重悬Stbl3沉淀：使用20 mL冻存液将Stbl3沉淀充分重悬（轻轻旋转，不要震荡和吹吸重悬），置于冰浴中作用10 min，形成Stbl3菌株备用；
（3）Stbl3菌株分装：将（2）制备的Stbl3菌株按照100 μL/1.5 mL EP管的比例进行分装；
（4）分装Stbl3菌株速冻：将分装置1.5 mL EP中的Stbl3菌株快速置于液氮中速冻；
（5）Stbl3菌株保存：将液氮中速冻的Stbl3菌株快速转移至-80℃冰箱中，长期保存。
3.4 Stbl3转化效率检测
（1）Stbl3菌株与质粒互作：将Stbl3菌株与质粒（阳性）或ddH2O（阴性）混匀，并置于冰浴中作用30 min（转化的质粒混合液体积不应超过Stbl3菌株的5%）；
（2）混合液热激：将冰浴的（1）混合液使用42 ℃热激90s（热激是一个关键步骤，可尝试使用进口EP管，且避免晃动）；
（3）再次冰浴：将（2）混合液转移至冰浴中，是Stbl3超级感受态细胞冷却2-5 min；
（4）Stbl3复苏：使用1 mL SOC/或LB液体混匀（3）菌液；于37 ℃，250-300 rpm 作用45-60 min后，完成细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因（SOC培养基相较于LB培养基可提高20%转化效率）；
（5）Stbl3菌涂板：使用适量体积（50-100 μL）涂布至含有质粒相应抗性的LB固体细菌培养板中；
（6）Stbl3菌培养：将（5）培养板置于细菌培养箱中（37℃，恒温恒湿），先正置15-20 min，然后倒置培养过夜（12-16h）；
（7）计算转化效率[6]：
转化子总数= 菌落数x稀释倍数x转化反应原液总体积涂板菌液体积
转化频率(转化子数/每ug质粒DNA) = 转化子总数/质粒DNA加入量(ug)
感受态细胞总数 = 无抗板菌落数x稀释倍数x菌液总体积/涂板菌液体积
感受态细胞转化效率 = 转化子总数/感受态细胞总数
表2 SOC培养基配制（1X）[9]
4 注意事项[10-12]
（1）全程无菌操作，尤其在感受态制备和转化效率检测的时候；
（2）提前准备好大量的冰，在制备过程中需要长时间的冰浴；
（3）杜绝反复冻融，反复冻融会降低Stbl3感受态的转化效率；
（4）待转化样品体积适量，一帮待转化样品体积不易超过Stbl3感受态的10%，否则导致转化效率下降；
（5）避免机械吹打，Stbl3感受态细胞对机械力非常敏感，混匀或者制备Stbl3感受态细胞时，避免使用震荡或机械吹打；
（6）Stbl3感受态细胞对温度变化非常敏感，在进行相关操作时候，应尽量控制高温度；
（7）其它。
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参考
[1] https://www.beyotime.com/product/D0378.htm
[2] http://www.virology.com.cn/thread-12582-1-1.html
[4] 【求助】关于stbl3的转化
[5] Al-Allaf FA, Tolmachov OE, Zambetti LP, et al. Remarkable stability of an instability-prone lentiviral vector plasmid in Escherichia coli Stbl3[J]. 3 Biotech, 2013, 3(1): 61-70.
[6] https://zhuanlan.zhihu.com/p/632139511
[7] https://zhuanlan.zhihu.com/p/148449423
[8] https://pro.biomart.cn/lab-web/method/316rdr2go2mm1.html
[9] https://www.biofeng.com/shiji/peiyangji/SOC.html#:~:text=SOC%E5%9F%B9%E5%85%BB%E5%9F%BA%20%28SOC%20Medium%29%E6%98%AF%E5%88%86%E5%AD%90%E7%94%9F%E7%89%A9%E5%AD%A6%E4%B8%AD%E5%B8%B8%E7%94%A8%E7%9A%84%E5%9F%B9%E5%85%BB%E5%9F%BA%EF%BC%8C%E7%94%A8%E4%BA%8E%E5%88%B6%E5%A4%87%E9%AB%98%E6%95%88%E7%8E%87%E7%9A%84%E5%A4%A7%E8%82%A0%E6%9D%86%E8%8F%8C%E6%84%9F%E5%8F%97%E6%80%81%E7%BB%86%E8%83%9E%EF%BC%8C%E4%B9%9F%E7%94%A8%E4%BA%8E%E7%83%AD%E6%BF%80%E5%90%8E%E6%84%9F%E5%8F%97%E6%80%81%E7%BB%86%E8%83%9E%E7%9A%84%E5%A4%8D%E8%8B%8F%E3%80%82%20%E7%94%A8950ml%E5%8E%BB%E7%A6%BB%E5%AD%90%E6%B0%B4%E9%87%8D%E6%82%AC31.886g%E6%9C%AC%E4%BA%A7%E5%93%81%E3%80%82%20%E7%94%A85 ,N%20NaOH%EF%BC%88%E5%A4%A7%E7%BA%A6%E9%9C%80%E8%A6%810.2ml%EF%BC%89%E8%B0%83%E8%8A%82pH%E8%87%B37.0%E3%80%82%20%E5%A6%82%E6%9E%9C%E9%85%8D%E5%88%B6%E5%9B%BA%E4%BD%93%E5%9F%B9%E5%85%BB%E5%9F%BA%EF%BC%8C%E8%B0%83%E8%8A%82pH%E5%90%8E%E5%8A%A0%E5%85%A515g%E7%90%BC%E8%84%82%E3%80%82%20%E7%94%A8%E5%8E%BB%E7%A6%BB%E5%AD%90%E6%B0%B4%E5%AE%9A%E5%AE%B9%E8%87%B31000ml%E3%80%82%20121%E2%84%83%E9%AB%98%E6%B8%A9%E8%92%B8%E6%B1%BD%E7%81%AD%E8%8F%8C15min%E3%80%82
[10]https://pro.biomart.cn/lab-web/method/316rdr2go2mm1.html
[11]https://zhuanlan.zhihu.com/p/632139511
[12]https://www.addgene.org/guides/lentivirus/
最后编辑于 2024-12-14 · 浏览 1137
