原核表达包涵体复性实例

前言

包涵体在原核表达中非常常见，但是没有一个通用的复性解决方案，常用的复性手段有稀释复性、透析复性、分子筛及离子柱层析等，复性遵循原则：低温、低浓度、小梯度，下面我们分享三个蛋白复性的实例。

先复性后纯化

1. 细菌破碎后离心收集沉淀，trisbuffer洗涤包涵体3-5次，跑胶检测包涵体纯度
2. 用5-10ml 6M盐酸胍（ph1.5）溶解包涵体，室温搅拌30min-1h，离心去除不溶物；
3. 将溶解后包涵体蛋白快速滴定到4℃预冷pbs中，缓慢搅拌，过夜复性，离心去除沉淀；
4. 缓慢加（40%）硫酸铵，3h后离心去沉淀（未完全复性的蛋白）；加终浓度70%硫酸铵，4℃过夜孵育，离心取沉淀，溶解到5-10ml pbs中即为目的蛋白。

复性结果如下图所示

图1.包涵体检测

泳道1：盐酸胍溶解包涵体 泳道2：包涵体洗涤后

图2.蛋白复性后检测

先复性后纯化

1. 破胞后洗涤沉淀，沉淀用变性剂buffer（8M脲）室温溶解3h后高速离心去除沉淀，上清中加入Ni填料，4℃混匀孵育2h；
2. 孵育结束后转移beads至层析柱，依次用不同浓度咪唑Wash buffer冲洗柱子；
3. Elute buffer洗脱蛋白后跑胶检测纯度；
4. 包涵体复性：变性蛋白测浓度后滴定入复性buffer（ 100 mM Tris–HCl, 0.5M 甘氨酸, 1 mM氧化型谷胱甘肽,10 mM 还原型谷胱甘肽, pH8.0） ，使蛋白终浓度为0.1mg/ml， 缓慢搅拌，4℃复性反应过夜，离心去除沉淀，上清转移到透析袋，pbs透析4h，换液至少2次，浓缩后过分子筛。

复性结果如下图所示

图3.包涵体纯化结果

泳道1为包涵体溶解后上清，泳道2为包涵体溶解后沉淀，泳道3为20mM洗杂，泳道4为40mM洗杂，泳道5为60mM洗杂，泳道6为100mM洗杂，泳道7为300mM洗脱，泳道8、9为500mM洗脱

图4.复性后检测结果

柱上复性

层析柱上复性与普通亲和层析操作类似，只是在细胞破碎时候用变性buffer（如8M脲），离心后上清蛋白溶液正常上层析柱，洗杂过程中依次降低变性剂含量，如8M-6M-4M-2M-1M-0.5M-0，使蛋白在层析柱上复性，最后用不含变性剂的咪唑buffer洗脱，即可得到复性后蛋白，实例图如下：

图5.亲和层析结果

泳道1为诱导前，泳道2为诱导后，泳道3为破碎后沉淀（变性剂破碎），泳道4为破碎后上清（变性剂破碎），泳道5为，泳道6为6M尿素洗杂，泳道7为4M尿素洗杂，泳道8为2M尿素洗杂，泳道9为1 M尿素洗杂，泳道10为0.5M尿素洗杂，泳道11为0M尿素复性洗杂，泳道12为300mM咪唑洗脱，泳道13、14为500mM咪唑洗脱。

复性洗脱后根据实验需求再进一步纯化即可。

小结

包涵体形成原因较多，方法也就不一而论，需要各种尝试才能找到一个合适的方法，需要一点运气，更需要的是对科研的探索精神