电转化（Electroporation）：感受态细胞制备原理及实操
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1背景知识介绍
1.1 电转和化转的异同
电转：是一种高效且非常普遍的转染/转化方法（用于难转材料）。在电转过程中，电脉冲在细胞膜上形成临时微孔，以便核酸等物质通过。这种通用方法可用于所有的细胞类型，适合 DNA、RNA、mRNA、RNP 或蛋白质的转染 [1]。化转：化学转化是通过骤冷骤热的方法使细胞诱导为原生质体（非常好的瞬时表达系统），再进行DNA转入的 [2-3]。
（图1 电转与化转的操作示意图 [5]）
1.2 电转化原理
电转染过程相当简单，将宿主细胞和选定的分子加入导电溶液中制成悬浮液，在混合物周围形成闭合电路。向细胞悬液释放电脉冲（优化电压，仅持续几微秒至 1 毫秒）。这会破坏细胞膜的磷脂双分子层，并在细胞膜上形成临时微孔。同时，细胞膜上的电势升高，驱使带电荷的分子（如 DNA）以类似于电泳的方式经临时微孔穿过细胞膜 [4]。
（图2 电转实现核酸等物质进入细胞示意图）
1.3 电转的关键因素
电转相较于化转尽管能够克服化转的缺点，但也需要控制好一下条件，方能为确保转染成功：1）电压、2）电阻、3）电容、4）缓冲液、5）电击次数、6）细胞（包括感受态细胞）状态、7）细胞（包括感受态细胞）数量。包括但不限于以上条件都会对电转造成影响。
1.4 电转的优缺点
电转优点：操作相对简单、对转化/染难度较大的细胞类型效果良好、结果可重现、无载体要求、对细胞类型的依赖性小、快速转化/染大量细胞；
电转缺点：需要专业设备、条件参数需要多次优化、可能产生负面影响导致细胞死亡。
2 电转感受态细胞准备工作
2.1 试剂耗材准备
提前准备及高压材料：SOB培养基（配方详见表1）、SOC培养基（只需要在SOB中培养基加入葡萄糖（终浓度20 mM）即可）、10%甘油（甘油/水=V/V）、ddH2O、锥形瓶、EP管、LB固体培养板、1 M 葡萄糖（18 g葡萄+100mL去离子水，需要使用0.22 μm滤器过滤）
表1 SOB培养基成分表（1L）[6-7]
2.2 菌种接种
将菌种从-80℃取出，在冰面上溶解，然后再37℃摇床上复苏30-45 min，使用细菌接种环沾取少量菌液以划线的形式将其置于LB细菌培养板中，如果没有细菌接种环，可以用涂布棒沾取少量菌液涂布置LB细菌培养板中。将LB培养板转移至37℃恒温恒湿细菌培养箱中，首先正置15-30min，然后倒置培养过夜（12-16 h）。
2.3 扩大培养
将获得的单克隆菌落转移至含有0.5 ml SOB液体培养的1.5 ml EP管中，培养4-6h，然后按照1:1000的比例进行扩大培养。扩大培养同样在37℃恒温恒湿细菌培养箱中，培养12-16h（没经验的情况下，建议在控制在10h以内）。
（图3 菌种单克隆扩培）
3 电转感受态制备
3.1 电转感受态细胞制备步骤
（1）评估菌种的OD值：按照1:1000比例接种培养的菌种，在培养10h后，可调节培养箱参数：330 rpm，37℃进行培养。每小时测量一次OD600，当OD超过0.5时，每15-20分钟测量一次（一般2h即可）；
（2）停止培养：当OD600达到0.72-0.76时，立即将细胞放在冰上。将培养物骤冷20-30 min，偶尔搅拌以确保均匀冷却，此时将离心瓶放在冰上（备注：此阶段以后，菌都应该处于冰冷环境中）；
（3）离心收集细菌沉淀：在4°C下3000g（或~4000 rpm）离心15分钟，弃上清，获得细菌沉淀；
（4）ddH2O重悬细菌沉淀：用预冷的ddH2O（纯净双蒸水，高压蒸汽灭菌）轻轻地重悬菌体，先加入少量水重悬菌体，然后把水加满，4℃ 3000g（或~4000 rpm）离心15分钟，弃上清。
（5）甘油重悬细菌沉淀：使用100mL 10%的甘油充分、轻柔地重悬细菌沉淀，然后执行4℃ 3000g（或~4000 rpm）离心15分钟，弃上清（重复一次，最后一次可以将离心瓶或离心管倒扣，将内部液体全部遗弃）。
（6）制备感受态细胞冻存样本：使用100 mL 10%甘油，轻柔并充分重悬感受态细胞（用于电转）沉淀；
（7）分装与冻存：按照100 μL/1.5 mL EP管进行分装，分装完成后立即转移至液氮中，最后完成分装工作后，将所制备的感受态细胞冻存于-80℃。
（重要提示：1）严格无菌操作；2）终止培养后的所有操作均需要冰冷环境）
（图4 电转感受态细胞制备及冻存示意图）
3.2 电转感受态细胞制备注意事项
（1）菌种活化后生长状态较好，因为电转会造成细胞死亡；
（2）培养器材务必保证洁净和高温灭菌；
（3）培养时间一定要控制好，细菌最好处于对数期/指数期阶段，无经验的情况下，务必在10h时开始评估OD值，一般情况12-16h可达要求；
（4）250 mM KCl和2M MgCl2 单独配制和高压，且MgCl2在使用前加入;
（5）完成细菌培养后，所有操作需要冰冷环境，因此在实验前一定备足冰；
（6）细菌完成培养后的所有以前均需要提前预冷（不低于15 min）；
（6）整个过程尽量不要用枪吹打，可震荡混匀。
4 电转化操作
经过验证，合格的感受态细胞即可用于后续基因克隆过程中的转化实验，质粒转化实验具体操作步骤如下：
4.1 电转化操作步骤
（1）感受态细胞解冻：从-80℃中取出感受态细胞，然后置于冰面上解冻；
（2）电击杯冰上预冷：提前将电击杯置于冰面上冷却（不低于30 min）；
电击杯冰上预冷 ，冻存的感受态细胞取出冰上融解
（3）感受态与核酸等混合：将100 uL感受态细胞，加入10 uL纯化产物（如果有条件可购买电击缓冲液，没有也行），冰上放置60s-90s；
（3）电击准备：将感受态和连接产物的混合液加入预冷的电击杯，保持电击杯外部干燥，防止电火花产生；
（4）电击操作：一般设置1.8 kV- 3kV，200 Ω，25 uF（BioRad 电转化仪，0.2电转化杯），电击时间应该在2－5 ms之间（数值越大，说明感受态细胞膜穿孔越强，但对感受态的损伤也越大，务必控制靠时间）；
（5）SOC培养基恢复：完成点击后，加入0.5 -1 mL 37℃预热的SOC培养基（无抗生素）将混合液洗出，此步有热激的作用；
（6）复苏：将上述菌液转移至37℃，220-250 rpm震荡培养45 min- 60 min，使其菌充分表达抗性；
（7）涂板：根据质粒的大小或转化难易程度，可以将复苏的菌液离心收集沉淀使用50-80μL LA培养基重悬涂布至含有特定抗性的LB板中（一般来说大质粒、难转化质粒需要离心收集沉淀，反之则不用）；
（图5 电转化操作流程示意图）
4.2 电转化注意事项
（1）保持低温：有助于电击造成的温度升高带来的负面影响，同时能够抑制细菌的增殖；
（2）连接液纯化：连接液尽可能纯化，去除离子，ddH2O溶；或者加入0.3-0.5uL未纯化的连接液，切勿过多以免电火花，我曾试过0.3 uL和0.6 uL连接液的加入细胞做对比，转化效率相当。
（3）电击参数务必设置好：应为仪器的不同，可能会使用不同的电击参数，因此在使用前认真阅读仪器使用说明书，一般来说，原核生物受体细胞电击以15kv/cm 场强为最佳，电击电压根据电击杯厚度选择；
（4）电击杯清洗：在完成电击后，电击杯需要充分洗净，可用针头（1 mL注射器）蒸馏水反复冲洗杯底，再用70％乙醇浸泡，4℃存放，使用前烘干即可；或者烘干后，-20度冰箱存放。
（5）复苏时间控制好：37℃复苏培养时间切勿过长，因为此时的SOC培养基不含有抗生素，如果时间过长会有滋生其它杂菌，导致实验成功概率降低。
参考：
1. https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home/references/gibco-cell-culture-basics/transfection-basics/methods/electroporation.html#:~:text=%E4%B8%8E%E5%85%B6%E4%BB%96%E8%BD%AC%E6%9F%93%E6%96%B9%E6%B3%95%E7%9B%B8%E6%AF%94%EF%BC%8C%E7%94%B5%E8%BD%AC%E6%9F%93%E5%85%B7%E6%9C%89%E8%AF%B8%E5%A4%9A%E4%BC%98%E5%8A%BF%EF%BC%8C%E5%85%B6%E4%B8%AD%E4%B8%BB%E8%A6%81%E4%BC%98%E5%8A%BF%E5%8C%85%E6%8B%AC%EF%BC%9A%E9%80%82%E7%94%A8%E4%BA%8E%E6%89%80%E6%9C%89%E7%BB%86%E8%83%9E%E7%B1%BB%E5%9E%8B%E7%9A%84%20%E7%9E%AC%E6%97%B6 ,%E5%92%8C%20%E7%A8%B3%E5%AE%9A%E8%BD%AC%E6%9F%93%EF%BC%9B%E5%9C%A8%E7%A1%AE%E5%AE%9A%E6%9C%80%E4%BD%B3%E7%94%B5%E8%BD%AC%E6%9F%93%E6%9D%A1%E4%BB%B6%E7%9A%84%E6%83%85%E5%86%B5%E4%B8%8B%EF%BC%8C%E8%83%BD%E5%A4%9F%E5%9C%A8%E7%9F%AD%E6%97%B6%E9%97%B4%E5%86%85%E8%BD%AC%E6%9F%93%E5%A4%A7%E9%87%8F%E7%BB%86%E8%83%9E%E3%80%82%20%E7%94%B5%E8%BD%AC%E6%9F%93%E7%9A%84%E4%B8%BB%E8%A6%81%E7%BC%BA%E7%82%B9%E5%9C%A8%E4%BA%8E%E9%AB%98%E7%94%B5%E5%8E%8B%E8%84%89%E5%86%B2%E5%8F%AF%E5%BC%95%E8%B5%B7%E5%A4%A7%E9%87%8F%E7%BB%86%E8%83%9E%E6%AD%BB%E4%BA%A1%EF%BC%8C%E4%BB%85%E9%83%A8%E5%88%86%E7%BB%86%E8%83%9E%E8%86%9C%E5%8F%AF%E4%BB%A5%E6%88%90%E5%8A%9F%E4%BF%AE%E5%A4%8D%EF%BC%8C%E5%9B%A0%E6%AD%A4%E7%9B%B8%E6%AF%94%E5%8C%96%E5%AD%A6%E8%BD%AC%E6%9F%93%E6%96%B9%E6%B3%95%EF%BC%8C%E7%94%B5%E8%BD%AC%E6%9F%93%E9%9C%80%E8%A6%81%E4%BD%BF%E7%94%A8%E6%9B%B4%E5%A4%9A%E6%95%B0%E9%87%8F%E7%9A%84%E7%BB%86%E8%83%9E%E3%80%82
2. https://www.zhihu.com/topic/20613716/intro
4. Shigekawa K, Dower WJ. Electroporation of eukaryotes and prokaryotes: a general approach to the introduction of macromolecules into cells. Biotechniques. 1988 Sep;6(8):742-51. PMID: 3273636.
最后编辑于 2024-11-07 · 浏览 5400
