感受态细胞制备与转化实验操作
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1 感受态细胞定义
感受态细胞（competent cell）是大肠杆菌（Escherichia coli）经过特殊（例如电击、CaCl2、RbCl(KCl等）处理后，细胞膜通透性发生改变进而能够允许外源DNA得以进入细胞 [1-2]。大肠杆菌结构比较简单（细胞壁、细胞质、核糖体、质粒和拟核等），其细胞质中的质粒常用作基因工程的运载载体，且它具备全基因组测序的优势，已经成为完善的基因克隆表达系统，已经被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物，目前也是生命科学领域用于基因克隆最常见的生物受体工具 [3]。
（图1 大肠杆菌实现基因克隆的基本示意图）
2 CaCl2改变膜通透性
细菌的细胞壁通透性都是较高的，而膜结构是以选择透过性，是半一种半透膜。因此，要改变细菌对外界DNA的摄入，主要是改变细菌细胞膜（生物细胞膜具有相似性）通透性，因为正常情况下，自然细菌摄入外界DNA的（即转化）发生频率低，10-2-10-10，不同细菌种类之间摄入差异很大 [1-2]。
2.1 低渗CaCl2诱导形成感受态细胞
在大肠杆菌处于快速生长其（指数期又称对数期）置于冰浴（或4℃处理过夜）预处理的CaCl2中。由于低渗作用，导致大肠杆菌膨胀成球状（通透性发生改变），即得到感受态细胞。
2.2 低渗CaCl2导致膜结构变化
Ca2+离子能够结合到膜上，主要有两种效应：1）细菌外膜结合大量的Ca2+离子形成正电荷磷脂分子层，有利于带负电的质粒结合；2）促使膜磷脂双分子层形成液晶结构，使得内外膜部分核酸酶解离，有利于膜通透性发生改变和外源DNA摄入。
（图2 CaCl2改变大肠杆菌细胞膜结构示意图）
3 感受态细胞摄入外源DNA
感受态细胞摄入外源DNA（重组DNA质粒）称之为转化（Transformation） [4]。在低温（0℃）环境中，将外源DNA与感受态细胞充分接触，外源DNA能够与感受态细胞膜极易形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附在感受态表面。通过短暂（60-90s）的热刺激（42℃）后，该复合物因细胞膜液晶状态发生剧烈扰动，并伴随膜间隙的出现，最终使得外源DNA被细胞摄入 [5]。
（图3 感受态细胞摄入外源DNA示意图）
4 感受态细胞制备实践操作
4.1 试剂准备
首先，需要配制1L LA（液体培养基）、1L LB（固体培养基）、1L mM CaCl2、1L mM MgCl2、100 mL 85 mM CaCl2+ 15%甘油（V/V）、离心管/瓶等均需要高压处理。完成高压灭菌后，需要提前预冷（0/4℃）。
4.2 菌种接种
将菌种从-80℃取出，在冰面上溶解，然后再37℃摇床上复苏30-45 min，使用细菌接种环沾取少量菌液以划线的形式将其置于LB细菌培养板中，如果没有细菌接种环，可以用涂布棒沾取少量菌液涂布置LB细菌培养板中。将LB培养板转移至37℃恒温恒湿细菌培养箱中，首先正置15-30min，然后倒置培养过夜（12-16 h）。
4.3 扩大培养
将获得的单克隆菌落转移至含有0.5ml LA液体培养的1.5 ml EP管中，培养4-6h，然后按照1:1000的比例进行扩大培养。扩大培养同样在7℃恒温恒湿细菌培养箱中，培养12-16h（没经验的情况下，建议在控制在10h以内）。
（图4 菌种单克隆扩培）
4.4 感受细胞态制备
（1）评估菌种的OD值：按照1:1000比例接种培养的菌种，在培养10h后，每小时测量一次OD600，当OD超过0.2时，每15-20分钟测量一次；
（2）停止培养：当OD600达到0.35-0.4时，立即将细胞放在冰上。将培养物冷却20-30 min，偶尔搅拌以确保均匀冷却，此时将离心瓶放在冰上（备注：此阶段以后，菌都应该处于冰冷环境中）；
（3）离心收集细菌沉淀：在4°C下3000g（或~4000 rpm）离心15分钟，弃上清，获得细菌沉淀；
（4）MgCl2重悬沉淀：大约 100mL冰冷的100 mM MgCl2对应250ml菌液收集到的沉淀，轻柔的将沉淀吹散（备注：目前绝大部分protocol没有这一步，添加这一步感受态细胞效果通透性更好，二价阳离子有助于改善细胞膜通透性）；
（5）离心收集细菌沉淀：4°C使用2000g （~ 3000rpm）离心15 min，弃上清收集细菌沉淀；
（6）CaCl2孵育细菌沉淀：使用200 mL 冰冷的100 mM CaCl2（对应250 mL菌液的沉淀）轻柔并充分重悬，冰浴至少20 min（一般是30-60min）（备注：此时的大肠杆菌可称之为感受态细胞）；
（7）离心收集感受态细胞沉淀：4°C使用2000g （~ 3000rpm）离心15 min，弃上清收集感受态细胞沉淀；
（8）85% mM CaCl2+15%甘油（V/V）预处理：使用100 mL85% mM CaCl2+15%甘油轻柔、充分重悬感受态细胞，然后执行4°C使用2000g （~ 3000rpm）离心15 min，弃上清收集感受态细胞沉淀；
（9）制备感受态细胞冻存样本：使用100 mL 85% mM CaCl2+15%甘油（V/V）轻柔并充分重悬感受态细胞沉淀；
（10）分装与冻存：按照100μL/1.5 mL EP管进行分装，分装完成后立即转移至液氮中，最后完成分装工作后，将所制备的感受态细胞冻存与-80℃（备注：此时的菌种OD600 = 200-250）。
（11）感受态细胞转化效率验证：将荧光质粒（普通的工具质粒即可）转化至感受态细胞中，然后提取质粒并转染至细胞查看荧光或者进行治疗PCR，检验转化效果。
（重要提示：1）严格无菌操作；2）终止培养后的所有操作均需要冰冷环境）
（图5 感受态细胞制备及冻存示意图）
5 质粒转化
经过验证，合格的感受态细胞即可用于后续基因克隆过程中的转化实验，质粒转化实验具体操作步骤如下：
（1）感受态细胞解冻：从-80℃中取出感受态细胞，然后置于冰面上解冻；
（2）质粒与感受态混匀：将目的质粒（一般是重组质粒或工具质粒）和解冻的感受态细胞轻柔的充分混匀；
（3）混合物冷激：将上述混合物置于冰浴中孵育25-30 min；
（4）混合物热激：将冷激的混合物置于42℃水浴锅中热激60-90 s（利于外源DNA进入感受态细胞）；
（5）恢复（recover）：将热激完成的混合物再次于冰浴中孵育2-5 min（利于感受态恢复原有状态）；
（6）复苏：将完成二次冷激的混合物中加入无抗生素的LA液体培养基，置于220 rpm，37℃复苏45-60 min；
（7）涂布：根据质粒的大小或转化难以程度，可以将复苏的菌液离心收集沉淀使用50-80μL LA培养基重悬涂布至含有特定抗性的LB板中（一般来说大质粒、难转化质粒需要离心收集沉淀，反之则不用）；
（图6 转化实验操作示意图）
参考：
[1] Lorenz MG, Wackernagel W. Bacterial gene transfer by natural genetic transformation in the environment. Microbiol Rev. 1994 Sep;58(3):563-602. doi: 10.1128/mr.58.3.563-602.1994. PMID: 7968924; PMCID: PMC372978.
[2] Hasegawa H, Suzuki E, Maeda S. Horizontal Plasmid Transfer by Transformation in Escherichia coli: Environmental Factors and Possible Mechanisms. Front Microbiol. 2018 Oct 4;9:2365. doi: 10.3389/fmicb.2018.02365. PMID: 30337917; PMCID: PMC6180151.
[3] Puurunen MK, Vockley J, Searle SL, Sacharow SJ, Phillips JA 3rd, Denney WS, Goodlett BD, Wagner DA, Blankstein L, Castillo MJ, Charbonneau MR, Isabella VM, Sethuraman VV, Riese RJ, Kurtz CB, Brennan AM. Safety and pharmacodynamics of an engineered E. coli Nissle for the treatment of phenylketonuria: a first-in-human phase 1/2a study. Nat Metab. 2021 Aug;3(8):1125-1132. doi: 10.1038/s42255-021-00430-7. Epub 2021 Jul 22. Erratum in: Nat Metab. 2022 Sep;4(9):1214. doi: 10.1038/s42255-022-00635-4. PMID: 34294923.
[5] https://zhuanlan.zhihu.com/p/451445083
[6] https://www.zhihu.com/question/452838754
[7] https://zhuanlan.zhihu.com/p/537906825
最后编辑于 2024-11-04 · 浏览 1387
