新技探秘 | 从实验室到临床，探讨“数字PCR技术”的奥秘与应用

当下国内各医疗机构大批量建设的PCR实验室（除三甲医院外，还有大量的基层区县级医院）可能面临着“无事可做”，入不敷出，亏本运营”的尴尬局面，也面临着巨大的资源浪费。因此，在当下阶段如何让PCR实验室生存发展起来成了考验医院决策者、检验科管理者的一个问题。我们的PCR实验室该如何更好的发展呢？当前我们基于的核酸检测技术，更多的是基于实时荧光定量PCR（qPCR）技术，具有高灵敏度、准确性和操作便捷的优势，但是由于qPCR仪荧光通道数量的局限性，所以大多只能对1-3个靶标进行检测分析，无法满足一些复杂的疾病诊断，如肿瘤防治、出生缺陷防控、安全用药指导等方向，通常需要涉及到更多基因变异检测情况，需要具备更广泛的检测能力的技术。

『新技探秘』系列，旨在为给各医疗机构实验室提供一些新技术、新项目、新平台开展的思路和方向。

一、数字PCR技术简介

数字PCR(Digital PCR,简称：dPCR），是一种核酸分子绝对定量技术，也被称为是第三代PCR技术，采用的也是PCR的扩增方法并通过荧光信号进行结果的判读。本质上是把弱信号从噪音信号中“拎”出来。包括准备反应体系、分割反应体系、PCR/分析结果三部分。

（图片来源于网络，侵删）

（1） PCR技术的发展历程

PCR技术发展至今已至第三代，依次经历了传统PCR技术（第一代PCR技术）、荧光定量PCR技术（简称：qPCR）（第二代PCR技术）， 数字PCR技术（简称：dPCR）（第三代PCR技术）三个阶段。

PCR技术发展历程

（2）数字PCR技术的分类

数字PCR的主要原理在于将PCR反应液分区至数万微反应单元，实现单分子扩增。根据分区的原理不同，主要分为两种：基于油包水微滴生成技术的微/液滴式数字 PCR(droplet digital PCR, ddPCR)和芯片式数字PCR（chip digital PCR，cdPCR）。

1. 微/液滴式数字 PCR（ddPCR）

将一个待分析的PCR反应体系进行微滴化处理，一次分割成千上万个单个油包水微小液滴，样品中的核酸分子随机分配到大量独立的微滴中，每个微滴中含有一个或不含待检核酸分子。对微滴体系进行扩增反应以后，分析每个微滴的荧光信号，进行有或无的判断，将判断结果按照泊松分布的原理，通过读取靶标和内参核酸的阳性微滴个数以及比例从而得到靶分子的拷贝数及浓度。

（举例：伯乐（Bio-Rad）QX-200）

2. 芯片式数字 PCR（cdPCR）

通过芯片设计，在芯片上蚀刻有上万个相同体积的微孔方阵，将纳升液体封闭在高通量的微池或微量通道中进行后续的PCR扩增及扩增后结果直接判读。

举例：赛默飞（Thermo Fisher）QuantStudio®3D

（3）数字PCR技术的特点

1. 绝对定量：不依赖标准品和参考曲线，通过终点荧光信号检测和计算阳性反应单元的比例来计算目的序列的拷贝数，可实现绝对定量检测。

2. 高灵敏度：样本需求量低，当检测难以捕获的样品或存在核酸降解的样品时，dPCR仍然具有较高的准确性；不仅能够检测出含量极低的突变，还能精确计算出每一种突变的频率。

3. 重复性佳：不受PCR扩增效率的影响。

4. 耐抑制性强：对乙醇、EDTA、SDS等PCR抑制剂具有较高耐受性；适合于复杂临床样品的检测，如粪便、痰液和组织样品等。

二、数字PCR技术在临床中应用

（1）相关规范要求

2023年9月28日，国家卫生健康委、国家中医药局、国家疾控局联合发布了《关于印发全国医疗服务项目技术规范（2023年版）的通知》。其中，34项数字PCR临床检验项目被纳入该技术规范，包括了感染、肿瘤，单基因遗传病，药物基因组等多个领域。该规范的发布为医疗机构开展相关项目的项目收费、临床应用提供规范。

由北京市医疗器械检验研究院、中国食品药品检定研究院、北京市医疗器械审批检查中心等共同起草的《YY/T 1918-2023 数字聚合酶链反应分析系统》行业标准于2023年9月5日发布，将于2024年9月15日开始实施。该标准规定了数字聚合酶链反应分析系统的分类，要求，试验方法，标签、标识和使用说明，包装、运输和贮存等内容；适用于对核酸样本以单液滴或单核酸分子方式生成数百个至数百万个独立反应单元的设备，分析系统包括微液滴生成模块、聚合酶链反应模块和微滴检测模块等。为数字PCR分析系统的企业制定了标准，加速了数字PCR市场的扩增。

（2）相关产品信息

国内数字PCR企业有永诺生物、小海龟、领航基因、科维思、泛生子、诺禾致源、新羿生物、迈克生物、臻准生物等。

（3）临床应用

1. 临床应用范围：可应用于肿瘤突变检测（组织活检&液体活检）、病原微生物检测、部分遗传病诊断、二代测序（NGS）文库定量等方面。

· dPCR在肿瘤液体活检中的应用：ctDNA检测与肿瘤靶向治疗、基因突变检测与治疗反应监测

· dPCR技术在感染性疾病分子诊断中的应用：病原微生物的鉴定与绝对定量（新型冠状病毒载量分析、 HIV病毒载量监测、牛结核杆菌的检测）、病原微生物耐药基因检测（耐药突变位点检测、耐药基因拷贝数检测）

· dPCR在无创产前诊断中的应用：dPCR技术的发展为无创产前诊断提供了新的技术手段，能够精确地量化母体中含量极低的胎儿游离DNA，以达到对遗传疾病的准确检测（脊髓性肌萎缩症、21三体综合征、地中海贫血）。

2. 标本选择类型：血液及其他体液（如脑脊液、尿液、粪便、泪液、痰液、唾液、支气管肺泡灌洗、胸腔积液、粘液、腹腔积液，穿刺物，胆汁或胰液）

3.临床专家共识：

3、数字PCR技术的挑战与发展

数字PCR（dPCR）作为第三代PCR技术，在灵敏度和精确度上达到了前所未有的高度，能在复杂背景下检测到罕见突变，达到对核酸的绝对定量，为病原微生物检测、肿瘤个体化治疗、耐药性研究、产前诊断等领域提供了新的技术手段。但是，对于dPCR在临床检验中的广泛应用仍存在限制和挑战：成本高，相较于qPCR，dPCR的仪器以及配套试剂成本较高；通量不够高，由于dPCR荧光通道的限制，对于多靶标样本的筛查需要更多的工作量；目前dPCR商业化的平台不够成熟，还未达到标准化的检测方法和数据处理方式；dPCR技术在医疗领域的应用还需要大量的临床样本验证。将来，通过dPCR技术的不断发展，以及与高通量测序、环介导等温扩增、质谱等技术的联合使用，dPCR技术会在临床分子检验中发挥更大的作用。

摘选来源：谢凤欣、靳伟东、田晖、和海妍、府伟灵、张阳，数字PCR技术在精准分子诊断中的应用：机遇与挑战，中华检验医学杂志, 2022,45(3) : 214-219

参考资料：

【1】谢凤欣、靳伟东、田晖、和海妍、府伟灵、张阳，数字PCR技术在精准分子诊断中的应用：机遇与挑战，中华检验医学杂志, 2022,45(3) : 214-219

【2】百度百科及网络

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