要点集萃|实时荧光聚合酶链反应临床实验室应用指南（WST 230-2024）

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近期，国家卫健委新发布了一系列检验医学卫生行业标准，其中更新《实时荧光聚合酶链反应临床实验室应用指南》WST 230-2024替代WST 230-2002。现将临床基因扩增检验实验室人员关注的要点整理出来，助您快捷获取。

01 “标本采集”环节，需注意：

1. 应结合不同检测项目对样本的要求，并参考所使用试剂及耗材的说明， 制定详细的样本采集程序，包括采样时效、采样部位、样本类型、采样装置与采集容器、采集方法、采样量、质量评价注意事项，并对采样人员提供相应培训与指导。

2. 实时荧光 PCR 技术可检测的临床样本类型包括组织（新鲜组织、石蜡切片组织）、细胞及其培养产物、EDTA 或枸橼酸抗凝全血、干血斑、血清、血浆、外周血单个核细胞、骨髓、其他体液（例如脑脊液、浆膜腔积液、尿液、房水等）、产前诊断样本（绒毛膜、绒毛膜培养细胞、羊水、羊水培养细胞等）、拭子（采集分泌物、脱落细胞、微生物等）、分泌物（痰液、脓液、唾液等）、体腔与体表冲洗液（含脱落细胞、cfDNA）、粪便、含微生物的临床样本或微生物培养样本，等。

3. 手术、输血、药物治疗等医疗行为可影响实时荧光 PCR 检测结果，采样前应明确患者有无接受上述诊疗行为，如有宜建议推迟采样或在报告中备注相关情况。

4. 病原微生物检测采样时遵守无菌操作，避免样本被环境微生物和定植微生物污染。

5. 全血和骨髓样本抗凝首选 EDTA 与枸橼酸盐，不可使用肝素。

02 “标本接收”环节，需注意：

让步检测标准（通常指在某些情况下，对不符合标准或规范的样本进行检测）：

1. 特殊情况下如必须进行检测，实验室就样本可抢救程度及检测可行性进行评估后，应就样本可能存在的检测影响因素充分告知临床医师，经沟通许可后行让步检验并将具体情况详细记录在案，同时在检测报告中备注样本特殊情况。

2. 明确存在以下情况的样本不宜进一步行 PCR 检测：肝素抗凝血样、无标识/标记错误的样本。溶血及经冻融的全血样本不宜用于 cfDNA 检测。

03 “样本处理”环节，需注意：

1. 均质化：当细胞、菌体、病毒被裹挟或黏附在其它物质内时，可通过均质化使其释放。例如：痰液样本宜先消化释放菌体；粪便样本宜机械混匀；组织样本宜剪碎研磨。

2. 组织样本处理：新鲜组织样本可采用均质器打匀、钢珠打磨、液氮研磨等方法对样本进行均质化，再以蛋白酶 K 消化处理。在没有新鲜或冷冻组织样本的情况下，可使用中性福尔马

林固定石蜡包埋组织（formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE）样本。FFPE 组织切片用于核酸提取前，应经过脱蜡、 乙醇漂洗、风干、蛋白酶 K 消化处理。

04 “预防污染与控制”环节，需注意：

1. 分子病理实验室宜设置独立的样本前处理区，包括切片区和脱蜡区，用于组织切片、脱蜡、水化、染色等。脱蜡、水化及染色操作应在通风设施中进行。

2. 实验室在工作前、工作后均应进行去核酸处理，包括：

a) 紫外线照射；

b) 使用 0.5％～1％次氯酸钠或 75％乙醇擦拭或其他方式处理；

c) 运用商品化核酸去除剂；

d) 保持实验室良好通风。

e) 因次氯酸钠具有较强腐蚀性，不可用次氯酸钠直接处理仪器设备。实验室应根据检测规模决定使用频率，使用次氯酸钠进行去核酸处理后应保持通风，降低实验室空气中的余氯含量。

3. 使用过的离心管、吸头宜用 0.5％～1％次氯酸钠溶液浸泡后按医疗废弃物处理。

05 “污染处理与控制”环节，需注意：

1. 当确认污染系个别样本交叉污染或环境中轻微气溶胶污染时：对于报告阴性或阳性的检测项目，结果为阴性的样本可正常报告，结果为阳性的样本应排除污染再次复检后方可报告；对于报告基因多态性的检测项目，需排除污染原因后复检。

2. 清除污染：宜先用 75％乙醇、纯净水或核酸清除剂（不含腐蚀性成分）沉降气溶胶，再经紫外灯消毒 30 分钟～60 分钟，然后用核酸清除剂或 0.5％～1％次氯酸钠溶液处理实验操作台、加样器和地面，部分检测器具可采用浸泡冲洗，最后予持续通风处理。

06 “质量管理”环节，需注意：

1. 人员管理：

a) 人员应具备相应分子生物学知识背景，接受过专门技术培训，取得 PCR 上岗证书。

b) 实验室应制定相关程序对人员进行管理保存所有人员记录，以证明各类资格、资质和培训考核等满足要求。

2. 设备管理：

a) 每台设备应有唯一标识。

b) PCR 实验室各物理分区中的设备为专用，应设置有明确标示。

c) 设备应始终由经培训的授权人员操作。

d) 实验室应保存每台设备检测性能的记录。

3. 设备检定和校准

以下实时荧光 PCR 检测相关设备应定期进行校准：全自动核酸检测系统、核酸提取仪、核酸 扩增仪、移液器、天平、温度计、水浴箱、恒温金属浴、离心机、生物安全柜、分杯仪和自动液体工作站。

07 “方法性能验证”环节，需注意：

1. 验证计划制定：检测方法用于临床前，实验室应独立进行方法性能验证。

2. 临床验证：临床检测方法在启用前后，实验室均宜选取临床明确诊断的受检者样本，进行方法学性能评价，以 验证检测方法达到临床应用的规定标准要求。

08 “室内质量控制”环节，需注意：

1. 实验室宜选择医学决定水平或与其值接近的质控品浓度，以保证决定值的有效性。

2. 室内质控宜覆盖从抽提至实时荧光 PCR 检测的全过程。

3. 扩增反应的质量控制：

a) 定性检测项目，每次实验应设置阴性、弱阳性和/或阳性质控品。

b) 定量检测项目，每次实验应设置阴性、弱阳性和阳性质控品。

c) 如为基因突变、基因多态性或基因型检测，则应包括最能反映检测情况的突变或基因型样本，每批检测的质控至少应有一种基因突变或基因型。宜设置某一时间周期，令周期内各批次检测所设置质控品监测位点合计可覆盖该检测项目所包含的所有位点。

4. 质控数据处理：宜尽量采用统计学和非统计学过程控制技术连续监测检测系统的性能，通常绘制室内质控图，每月或间隔特定周期对室内质控进行总结和记录。

5. 实验室间比对：

a) 当无实验室间比对计划可利用时，实验室应采取其他方案并提供客观证据确定检测结果的可接受性。

b) 替代方案：当无实验室间比对计划可利用时，实验室可寻找其他有相关检测资质的实验室，按照上述方法定期进行实验室间比对，每年不宜少于 2 次。

09 “结果判读与报告”环节，需注意：

1. 结果判读：

判读结果前应先查看下列情况的样本扩增曲线形态，并根据项目 SOP 设定各荧光信号通道判读阈值：

a) 查看标准品扩增曲线是否正常，曲线参数是否在试剂说明推荐范围内。

b) 查看阳性质控品扩增曲线是否正常，Ct 值是否在试剂说明推荐范围内。

c) 如设置有内对照，查看其扩增曲线是否正常，Ct 值是否在试剂说明推荐范围内，以确保核酸提取的有效性。

d) 查看阴性质控品扩增曲线是否正常，仅在其未见明显扩增且阴阳性质控检测结果均满足实验室要求时，才可判读并发布该批次检测结果报告。

e）定性项目依据试剂盒声明的判断标准进行结果判读；定量检测项目根据分析测量范围下限和上限报告定量检测结果，当结果超出分析测量范围时宜直接报告超出上限。鉴于 PCR 对稀释误差的指数级放大效应，不宜进行样本稀释检测。

2. 如检测结果怀疑样本中存在有抑制物，应考虑进行稀释验证。

3. 结果报告基本要素：至少包括受检者姓名和唯一标识、检测方法、报告项目中文和/或英文名称、计量单位（应尽可 能使用 SI 单位）、样本采集日期和时间、实验室接收样本的时间、报告发布日期和时间、检测者和报 告者姓名和实验室信息。

10 “实验室生物安全”环节，需注意：

1. 实验室应在卫生行政主管部门进行生物安全备案。

2. 实验室所属机构应成立生物安全委员会，建立生物安全管理体系。

3. 实验室应对实时荧光 PCR 检测活动中涉及的致病性生物因子、涉及致病性生物因子的检测活动、感染性废弃物处置过程中的风险、从事检验工作人员的健康状况和安全知识水平、实验室设备和应急处理措施进行风险评估，并依据风险评估结论采取相应的风险控制措施。

参考资料：

《实时荧光聚合酶链反应临床实验室应用指南》WST 230-2024

来源：验小六的晚课时间

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