病例第 35 轮长征疑难肿瘤MTB会议 | 解析NGS助力原发灶不明转移癌的诊断与治疗方案

案例一

患者女，66岁，2023.03因胆结石行胆囊切除术，术中发现腹壁多发结节，行活检术，术后病理显示结节低分化癌，补充报告示转移性低分化腺癌，建议在消化、泌尿、及女性生殖系统寻找原发灶。2023.11 PET-CT显示胆囊术后改变，腹膜、网膜、肠系膜多发增厚伴结节形成（部分病灶与肝、脾、子宫分界不清），右侧心膈角、腹腔及腹膜后增大淋巴结，右中腹壁及前上腹壁结节，葡萄糖代谢增大，均考虑转移灶；余纵膈及左侧盆壁小淋巴结，葡萄糖代谢轻度增高。2024.06就诊于我科，行腹壁结节穿刺活检，结果提示转移性低分化癌，并提示首先在女性生殖系统找原发灶。

基因检测结果：为寻求精准治疗，患者接受了733基因panel进行检测。结果显示，受检肿瘤组织存在CDK12突变（HRR通路突变），FGFR1-HTRA4基因重排，TP53突变、AKT2等多个基因基因拷贝数增加，MSS。

问题讨论

1. 大量CNV事件有何提示意义？

2. AKT2 扩增的靶向治疗启示？

3. FGFR1重排用药情况如何？

4. CDK12突变有何临床意义？

分子生物学分析（高宁）

1.大量CNV事件有何提示意义？

有文献报道转移性乳腺癌MYC扩增比例高（约15%），且染色体8q上的其他基因常与MYC共同扩增，包括PTK2、PREX2和 PRKDC，MYC扩增肿瘤中CNV的增加可能导致基因组不稳定，并可能导致其更具侵袭性1。另有研究显示高级别浆液性卵巢癌中常检测到PTK2（12/47，25.5%）、MYC（9/47，19.1%）、MDM4（5/47，10.6%）和 ZNF217（5/47，10.6%）基因拷贝数增加，且表明染色体不稳定性与肿瘤进展相关2。同时有文献报道高级别浆液性卵巢癌的特点是普遍存在TP53突变、HRR通路变异3、基因组不稳定性和广泛的拷贝数变异，CCNE1和AKT2扩增事件常同时发生4。此外，BIRC5基因变异在癌症中相对少见，仅在 2%（ n = 196）的病例中发现 ，主要变异形式是DNA扩增，在子宫癌肉瘤、浸润性乳腺癌、肝细胞癌、间皮瘤和卵巢癌中变异频率最高，分别为 5.3%、4.2%、4.0%、3.5% 和 3.1%5。KRAS扩增在大多数肿瘤类型中很少见，但在生殖细胞肿瘤（24%）和食管腺癌（18%）中很常见，卵巢癌中检出率约5.4%6。结合以上，患者的整体突变特征与高级别卵巢癌具有较高的相似性。

2.AKT2 扩增的靶向治疗启示？

AKT也称为磷酸激酶B (PKB)，AKT丝氨酸/苏氨酸激酶家族共发现了三种高度同源的亚型，即AKT1（PKBα）、AKT2（PKBβ）和 AKT3（PKBγ）。PTEN缺失、AKT/PIK3CA突变或扩增等都会引起AKT信号通路的过度激活，导致肿瘤的发生和发展7。CAPItello-291研究是一项全球性、多中心、双盲、随机的III期临床试验，旨在评估capivasertib对比安慰剂联用氟维司群治疗ER+/HER2-乳腺癌患者的疗效和安全性，这些患者在接受芳香酶抑制剂治疗期间或之后疾病复发或进展，约40%的患者肿瘤携带 PI3K/AKT1/PTEN 基因改变，结果显示在伴有AKT通路异常的患者中，mPFS为7.3m vs 3.1m(p＜0.001)8。另有病例报道显示一名 74 岁的白人女性，晚期肺腺癌伴脑转移、骨转移（野生型EGFR，无ALK重排）。经化疗PD后FISH 检测显示RET基因重排。由于脑部疾病进展，患者参加了凡德他尼和依维莫司的临床试验（NCT01582191），NGS检测显示除KIF5B-RET融合外还有AKT2等基因扩增，患者对治疗的耐受性好，体能状态和生活质量有所改善，2个疗程后，脑部 MRI显示颅内疾病负担有所减轻，PET-CT显示右半胸腔也有响应9。

2. FGFR1重排用药情况如何？

佩米替尼已获批用于治疗带有FGFR1基因重排的复发或难治性髓系或淋巴系肿瘤成人患者的适应症，但是在实体瘤中暂无适应症10。RAGNAR研究中217例FGFR基因改变的晚期实体瘤患者纳入研究，其中FGFR1融合或突变10%，73%的患者观察到肿瘤缩小，ORR为30%，DCR为74%，mDOR为6.9月，mPFS为4.2月，mOS为10.2月，不同类型的FGFR基因均观察到了应答反应11。但是患者经DNA-NGS检测发现的FGFR1重排形式为FGFR1-HTRA4(E1-9:E1-6)，参与重排的基因均只提供5’端上游序列，似乎不能形成有功能的蛋白，建议进一步进行RNA验证是否存在RNA水平上的融合。

3. CDK12突变有何临床意义？

CDK12属于HRR通路基因，FDA批准奥拉帕利用于携带HRR基因生殖系或体系有害或疑似有害变异，且既往接受恩扎卢胺或阿比特龙治进展的转移性去势抵抗前列腺癌成人患者的治疗12。一项研究纳入38例卵巢癌患者，13.2%检出了CDK12体细胞突变，与没有BRCA1/2或CDK12突变的患者（mPFS 13.6个月p=0.004）相比，携带BRCA1/2和/或CDK12突变的患者显示出更长的PFS（mPFS 36.0 个月）13。

临床团队分析和方案选择（焦晓栋教授）

患者手术之后一直没有接受过任何治疗，基因检测结果出来后，终于有了可以考虑的方案。根据基因检测结果，可以考虑的方案有铂类+紫杉醇类化疗+抗血管治疗、PARPi等方案。但是患者一般状况差，无法耐受全身化疗，在DNA-NGS测到了FGFR1重排的情况下，尝试口服佩米替尼单药，1月后疗效评价为缩小的SD，患者的腹水消失。

其他临床专家观点

焦晓栋教授：如何从报告上看出重排是有功能的重排还是5-5重排等形式？当DNA-NGS检测到5-5或3-3重排时，如何判断其有无功能？

（高宁：从报告检测结果的书写形式上，如FGFR1-HTRA4(E1-9:E1-6)，一般不能判断，在报告的变异详细解读中可以明确，如本例患者的报告明确提示：“受检者检测到的重排中，参与重排的基因均只提供5’端上游序列，似乎不能形成有功能的蛋白。但有证据显示，由于染色体结构变异的特殊性和复杂性、以及转录后加工等机制的存在，DNA水平的结构变异不能准确预测最终蛋白存在与否。对于复杂的结构变异常推荐不同平台的结果（如RNA检测、qPCR等）相互佐证。鉴于以上研究结论，建议进一步进行RNA验证是否存在RNA水平上的融合”。此外，遇到DNA检测到的5-5或3-3重排，一般可以根据其是否包含启动子、终止子等转录原件以及功能基因是否包含激酶结构域初步判断是否发生转录翻译，但是建议在RNA或蛋白层面最终明确。例如一项大型研究纳入41869位患者，通过不同的检测手段检测RET融合，共有13例经DNA-NGS检测为5-5或3-3重排，经RNA-NGS验证后，4例存在融合转录本，9例没有融合转录本14。）

（本患者在MTB会议后，经RNA-NGS检测未发现在转录组层面发现FGFR1融合，患者的后续疗效值得密切跟踪。）

柳柯教授：KRAS扩增在胃腺癌和食管腺癌中的发生率分别约为10%和15%，KRAS扩增的患者对抗HER2治疗可能存在耐药。

臧教授总结：这个病例体现了原发灶不明转移癌可以通过基因检测，来辅助判断原发灶的来源，本例患者发生扩增的几个基因在高级别浆液性卵巢癌中的发生率较高，提示患者倾向高级别浆液性卵巢癌，同时本例患者与常见卵巢癌患者肿瘤恶性程度低于胰腺癌等消化道肿瘤、易发生腹腔转移、向胸腔等远处转移的概率更小等临床进展特点相吻合，这也提示我们除了一些根据数据库拟合专门做肿瘤原发灶推测的检测，我们常规做的NGS检测也可以给到一定的辅助提示作用。

其次，在众多基因发生变异的情况下，治疗方案该如何选择。首先要明确的是，不是患者检测到了变异，且报告中有药物推荐，这个药物就一定能在临床上转化为有效的方案，比如AKT家族，它在信号通路上处于下游位置，根据既往的临床经验和生信的调研分析，它对应的靶向治疗疗效差于处于信号通路上游的靶点，如EGFR、ALK等。再加上本例患者的AKT2扩增在AKT通路上罕见，针对这个靶点治疗的优先级应该靠后。患者还检测到了HRR通路上CDK12基因突变，在妇瘤中的发生率较高，也是再次验证了她的病灶倾向来源于卵巢，也有研究显示CDK12突变与铂类化疗敏感相关，如果患者的身体条件可以接受，铂类联合紫衫类化疗是一个可以优先考虑的方案，但是本突变针对PARPi的治疗并没有高级别的循证证据。针对FGFR1重排，今天也看到了有研究显示也有从佩米替尼中获益的可能性，因此选择佩米替尼治疗是一个合理的选择，但是在该患者DNA层面的FGFR1重排，最终能否发生转录仍需要验证。同时需要提示的是，当患者体力状况恢复至可以耐受化疗时，可以考虑用上化疗方案，因为铂类联合紫衫类化疗针对卵巢癌的疗效是经过临床验证的。

案例二

患者女性，55岁。乳腺癌术后，经多线治疗后出现疾病进展。2023年2月于长征医院对该患者进行了首次MTB讨论，既往病史和治疗可参见上次MTB报道（ https://mp.weixin.qq.com/s/N5VDDkLTnos__xt3TJy3Og ）。患者检出BRAF V600E突变，并依照MTB建议的方案进行治疗，疾病情况更新如下：

2022-10-20、2022-11-17、2023-02-01至今予曲美替尼+达拉非尼靶向治疗联合茵福针10mg保骨治疗。用药后血小板逐渐回升；肝脏肿瘤明显缩小，肿瘤标记物显著下降。2022-11-17、2023-04-10、2023-6-5、2023-8-7、2023-10-08入我院复查，评估疗效SD。

2024-3月开始出现肝功能不全、肿瘤标志物升高；复查影像学未见肝脏病灶明显变化。

2024-4-8，(肝穿刺活检)：转移性癌。注：结合免疫组化(肿瘤细胞CK8/18+，GATA-3+，E-Ca+，P120膜+，Syn和CgA弥漫+，ER 2+，50%，Ki-67+，30%)，可符合浸润性乳腺瘤，治疗后向神经内分泌癌转化，未见肿瘤坏死。

基因检测结果

讨论问题

1.BRAF V600E靶向治疗的耐药机制？

2.BRAF双靶治疗耐药后的治疗选择？

分子生物学分析（王晶）

1.BRAF V600E靶向治疗的耐药机制？

PI3K信号通路异常：一项研究纳入41位携带BRAF V600E突变的mCRC患者接受维罗非尼、伊立替康和西妥昔单抗（VIC）治疗，其中20 例患者在基线和 PD 时有配对血浆样本。对比两次ctDNA检测结果发现约50%的原发耐药患者存在PI3K信号通路突变。此外，MAPK、PI3K信号通路以及PDGFRB信号通路突变也可能与VIC耐药相关。分析基线ctDNA结果与预后的相关性，提示VIC治疗前存在PI3K或DDR通路变异的患者PFS显著更短[1]。

RAS-RAF-MEK通路再激活：Match-R研究纳入了11例BRAF V600E突变NSCLC，靶向治疗后无进展至少6个月（大部分为达拉非尼+曲美替尼，D+T），其中7名患者获得了耐药前后完整的分子图谱。4名患者检测到KRAS、NRAS、MEK1等突变，提示MAPK通路可能是促使D+T耐药机制发生的关键^[2]。

组织学转化：一例携带BRAF V600E变异的复发性胶质母细胞瘤患者，经BRAF + MEK 抑制剂联合治疗后获得PR（肿瘤缩小55% ）。18个周期后脑部出现新病变，组织学显示局部转化为胶质肉瘤。同时NGS检测出现KRAS G12D 和 NF1 L1083R突变 ^[3]。

2.BRAF双靶治疗耐药后的治疗选择？

伴神经内分泌分化的乳腺癌（NECB）约占所有浸润性乳腺癌的2%-5%，通常表现为ER+，HER2-。其诊断主要依赖于神经内分泌标志物的表达（嗜铬粒蛋白 A或突触素表达水平＞50%）。我们常说的具有神经内分泌特征的乳腺癌是一组异质性肿瘤，既包含伴有神经内分泌分化的乳腺浸润性癌，也包括原发于乳腺的神经内分泌肿瘤，还包括某些具有神经内分泌形态和（或）神经内分泌标志物表达的特殊类型乳腺癌（如小叶癌）。由于缺乏严格的定义，此类肿瘤的名称较为混乱，大多研究存在异质性[4]。

NECB的分子特征不同于常见乳腺癌亚型，最常见的突变基因是ARID1A、GATA3、FOXA1、PIK3CA和AKT1（17%）等。与常见的ER+/HER2-亚型相比，NECB 携带PIK3CA突变的频率较低（p<0.05），而ARID1A、FOXA1突变频率明显更高，TP53突变也比较罕见[5]。

对于原发部位在肺外的差分化神经内分泌癌患者，NCCN指南[6]推荐的治疗方案如下：

乳腺神经内分泌癌目前缺乏标准治疗，后线可选的治疗方案十分有限。对于转移性患者，研究显示，姑息性全身化疗是主要的一线治疗方法。通常参考小细胞肺癌（SCLC）以依托泊苷加铂类（顺铂或卡铂）作为标准方案（回顾性数据中位显示PFS为6个月，OS为10-14个月）。二线及后续治疗可选方案有靶向治疗±内分泌治疗（如替莫唑胺、CDK4/6 抑制剂等），免疫检查点抑制剂治疗（双免联合或单药（TMB-H/MSI-H患者））[7]。

一例高级别浸润性神经内分泌乳腺癌患者，激素受体阳性，HER2阴性。同时有左肝病变以及胸椎、腰椎的转移性病变。先后接受卡铂+依托泊苷、内分泌治疗后出现弥漫性转移性肝病。开始服用哌柏西利，1个月后左侧锁骨上淋巴结新发，遂联用氟维司群和促性腺素释放激素激动剂。患者对该方案表现耐受，原发及转移灶均有所改善，最终获得18个月的PFS。这是第1例在原发性NECB中使用 CDK 4/6 抑制剂的病例[8]。

在非乳腺来源的神经内分泌癌患者中也有一些使用抗血管生成药物的小型队列探索[9-11]。小肠NEC患者一线治疗使用CAPOXIRI+贝伐单抗，后通过帕唑帕尼+卡培他滨进行维持治疗，总体ORR 达到47.4%，中位 PFS 为 13 个月，中位 OS 为 29 个月[9]。一项研究[10]将帕唑帕尼用于消化道来源的GEP-NEC（N=13）患者，ORR 为 23%，中位 PFS 为 5.8 个月。另一项研究[11]报道了舒尼替尼治疗GEP-NEC（N=20）患者的DCR为 55%。

此外，一些与神经内分泌癌分子靶向治疗相关的临床试验（如mTOR抑制剂、细胞周期抑制剂或影响表观遗传调控的药物）正在进行中[12]，部分对肿瘤原发部位未做限定的研究可优先考虑。

3.后续治疗建议及总结

发生组织学转化可能是患者当前双靶治疗耐药的最主要原因；

原发性乳腺神经内分泌癌十分罕见，且异质性较强，由于没有统一的定义和诊断标准，与伴有神经内分泌分化的乳腺癌经常混淆，患者的神经内分泌癌成分究竟为乳腺原发（因异质性未发现）还是治疗后发生转化尚未可知。

NECB目前缺乏标准治疗，后线可选方案也十分有限，转移性患者可参考小细胞肺癌进行治疗。本案例患者后续可考虑：a. EP/IP等化疗方案（如可耐受）；b. 内分泌治疗±CDK4/6抑制剂；c.抗血管靶向治疗（参考其他癌种）；d. 临床试验等。

临床团队分析和方案选择

柳珂教授：该患者乳腺原发灶和骨活检病灶最初均表现为激素受体阳性，而首次肝组织的穿刺结果为三阴性，可能因不同转移部位之间存在异质性，而非发生内分泌受体的转化。我们发现BRAF抑制剂最初对患者十分有效，但随着耐药的发生，个人倾向认为此时的组织学亚型还是以激素受体阳性为主。临床上乳腺癌中发生神经内分泌转化并不罕见，文献报道的发生率约为10%~30%。对于该患者的后续治疗，我们也在思考在EP方案基础上是否要联合免疫？ 

陈诗绮教授：该患者很好的体现了乳腺癌的时间异质性和空间异质性，患者每次的基因检测结果也不完全一致，BRAF V600E突变是在血检中发现，而组织中并未检出；鉴于检出PIK3CA突变，最初我们认为后续或可考虑PI3K抑制剂联合免疫治疗。然而，耐药后的病理提示发生神经内分泌癌转化。如前面生信分析提及，乳腺癌神经内分泌转化十分复杂。相比伴有神经内分泌分化特征的乳腺癌，纯然的乳腺神经内分泌癌极为罕见。患者当前已经多线治疗失败，EP联合免疫可能是比较好的选择。

焦晓栋教授：在肠癌中针对BRAF突变使用D+T联合FOLFIRI、爱必妥也会出现疾病快速进展，背后的耐药机制尚不明确。如能像肺癌EGFR突变耐药一样明确具体原因，后续也可继续使用靶向治疗。反之，更建议考虑免疫+化疗方案。是否要加入抗血管治疗以及应选择哪类药物需结合患者的器官功能状态再做进一步评估。

臧教授总结：通过回顾和学习该病例，我们发现各类肿瘤经长期治疗后都会发生治疗压力下的转化或选择，该病人的神经内分泌癌成分是一开始就存在还是由肿瘤不断进化而来，这尚未可知。如果观测的时间足够长，同时进行必要的肿瘤活检，我们会发现很多肿瘤都会发生神经内分泌癌转化，这是肿瘤修炼升级为“王者”的关键特征。其次，该病例针对BRAF突变使用达拉非尼+曲美替尼治疗无疑是成功的。NCI-MATCH研究虽未纳入乳腺癌患者，但考虑到D+T已获批了泛癌种适应症，遂尝试使用该方案并使患者获得了17.4个月的PFS，明显超过了之前研究报道的11.4个月的mPFS，十分令人欣喜。第三，如果患者后续还有治疗选择的机会，我也比较赞同参考小细胞肺癌（SCLC）一线治疗选择化疗+免疫方案。此外，在肠癌中既往BRAF靶向治疗耐药后通过免疫来桥接也比较常用。至于抗血管治疗，考虑到化疗在SCLC中已有较高的ORR，加入后可能带来的获益提升空间不大。因此，疾病进展后更建议先停止化疗，再考虑序贯TKI+免疫，如此可能更为合理。