CGP论著 | 补肺益肾组分方Ⅲ组分配伍对慢性阻塞性肺疾病大鼠气道重塑的干预作用研究
慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是以不完全可逆性气流受限为主要特征的可以预防和治疗的疾病。气道重塑是COPD的重要病理机制，与COPD气道狭窄和不可逆性气流受限密切相关。气道重塑主要发生在小气道，是气道受损引起的气道壁结构变化和反复修复的过程，以气道结构变化、气道壁增厚、管腔狭窄为主要特征［1-2］。气道重塑的机制尚不完全清楚，目前认为与炎症反应、氧化应激、蛋白酶/抗蛋白酶失衡、细胞外基质沉积等有关［3-5］。多种病理环节导致的气道重塑引起气道管腔狭窄，使气流阻力增加、气流受限，最终形成不可逆的慢性气流阻塞，是COPD病情发展和转折的重要环节［6］。因此，有效干预气道重塑将是治疗COPD的重要手段。补肺益肾方是临床治疗COPD的有效方剂，可减轻患者临床症状，减低急性加重次数，提高患者生存质量［7-8］。中药有效组分配伍组成的组分方是研发现代中药的新模式，便于进行药物质量控制，有助于阐释药物作用机制。本课题组前期基于系统药理学方法并结合体内外实验，在补肺益肾方的基础上经补肺益肾组分方（effective-component compatibility of Bufei Yishen formula，ECC-BYF）Ⅰ、ECC-BYF Ⅱ［9-11］，优化成由人参皂苷Rh1、黄芪甲苷、淫羊藿苷、川陈皮素、丹皮酚组成的ECC-BYF Ⅲ［12］。前期研究发现ECC-BYF Ⅲ对COPD大鼠有较好的疗效，且能显著抑制COPD大鼠气道重塑［13］，但其组分配伍对COPD气道重塑的干预特点仍需进一步研究。
鉴于上述原因，本研究在中医理论指导下，按原单味药功效，将ECC-BYF Ⅲ分成补气类代表组分（人参皂苷Rh1、黄芪甲苷）、补肾类代表组分（淫羊藿苷）、化痰类代表组分（川陈皮素）和活血类代表组分（丹皮酚）4类，进行不同组分配伍，基于香烟烟雾暴露联合反复细菌感染诱导的COPD稳定期大鼠模型，评价ECC-BYF Ⅲ及其组分配伍干预COPD气道重塑的配伍特点。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 动物：SPF级SD大鼠216只，体质量（200±20）g，雌雄各半，购于河南省实验动物中心（SCXK〔豫〕2017-0001）。所涉及实验已通过河南中医药大学第一附属医院实验动物福利伦理审查委员会审查（伦理审查批准编号：YFYDW2019031）。
1.1.2 香烟与细菌：红旗渠过滤嘴香烟（硬金红，河南中烟工业有限责任公司生产，烤烟型，焦油含量11 mg，烟气烟碱含量0.9 mg，烟气一氧化碳含量11 mg）；肺炎克雷伯杆菌（菌株号：46117），由中国药品生物制品检定院中国医学细菌保藏管理中心提供。
1.1.3 主要药品与试剂：人参皂苷Rh1（CHB180608）购于成都克洛玛生物科技有限公司；黄芪甲苷（MUST-17022804）、淫羊藿苷（MUST-16111710）、丹皮酚（MUST-16071405）购于成都曼斯特生物科技有限公司；川陈皮素（HL-20170312）购于西安汇林生物科技有限公司；氨茶碱片（100 mg/片×100片）购于山东新华制药股份有限公司。伊红染色液（71014544）、二甲苯（10023428）、无水乙醇（10009218）、中性树胶（10004160）等由国药集团化学试剂有限公司提供；苏木素染色液（H9627）由美国Sigma公司提供。大鼠基质金属蛋白酶12（matrix metalloprotein 12，MMP-12）、酶联免疫吸附试验（ELISA）Kit（E-EL-R0044c）、大鼠碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF） ELISA Kit（E-EL-R0091c）、大鼠胶原蛋白（collagen，COL）-1 ELISA Kit（E-EL-R0233c）、大鼠COL-3 ELISA Kit（E-EL-R0233c）购于武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司。
1.1.4 主要实验仪器：IVC-Ⅱ型动物饲养笼具（冯氏实验动物设备有限公司，苏州）；ELX800UV型酶标仪（BIO-TEK，美国）；RM2145型自动切片机（Leica，德国）；DMI3000 B型荧光显微镜（Leica，德国）。
1.2 实验方法
1.2.1 动物分组与药物干预：于2018年5—9月进行动物实验，大鼠饲养条件为：温度（25±2）℃，相对湿度（50±10）%，给予无菌水及饲料常规饲养，每日更换垫料。适应性饲养1周后，将大鼠随机分为18组，每组12只，雌雄各半。1~8周采用香烟烟雾暴露联合反复细菌感染的方法制备COPD稳定期大鼠模型，每4周检测大鼠肺功能，根据肺功能变化评价模型是否成功［14］（正常组除外）。9~16周各组给予相应的药物干预。采用等效剂量系数换算公式计算；公式为：D大鼠=D人×（HI大鼠/HI人）×（W大鼠/W人）2/3，D表示剂量，HI表示体型系数，W表示体质量。动物分组与药物干预具体情况见表1。
1.2.2 大鼠取材：第17周，药物干预结束后取材（每组6只），取材前1 天大鼠禁食禁水。大鼠麻醉后，经腹主动脉采血，分离血清；取出肺组织，结扎右支气管，预冷的1×磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）灌注左肺3次，收集支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），离心后取上清液，保存于-80 ℃备用。
1.2.3 常规苏木素-伊红（hematoxylin eosin，HE）染色：左肺进行4%多聚甲醛灌注固定，蜡块包埋，切4 μm切片，进行常规HE染色。显微镜下选择直径200~400 μm形状规则的气道，测量其内径和外径，根据公式：气道壁厚度（μm）=外径长-内径长，计算气道壁厚度。测量气道外周长及内周长，统计气道平滑肌细胞数，根据公式：平均气道平滑肌细胞数（个/mm）=细胞总数/（外周长-内周长），计算平均气道平滑肌细胞数。
1.2.4 ELISA法检测血清bFGF、MMP-12及BALF中MMP-12、COL-1、COL-3水平。
1.3 Region（R）值综合评价
采用R值综合评价法（著作权号：国作登字-2013-A-00096833）对大鼠血清及BALF中气道重塑相关指标及总指标进行综合评价。R值综合评价法是根据疾病对指标的影响和药物对指标的纠正作用，计算药物对指标的纠正强度，考察药物对多个指标的综合作用［15］。
1.4 统计学方法
实验数据采用IBM SPSS 22.0统计学软件进行统计分析。计量资料方差齐者采用最小显著差（least significant difference，LSD）法，方差不齐经数据转化后用LSD法以（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析。显著性水准取α=0.05。
2 结果
2.1 ECC-BYF Ⅲ及其组分配伍对COPD大鼠病理变化的影响
18组大鼠气道壁厚度、平均气道平滑肌细胞数比较，差异有统计学意义（P<0.05）。与正常组比较，模型组大鼠气道壁增厚，平均气道平滑肌细胞数增多，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，ECC-BYF Ⅲ及其组分配伍、氨茶碱组大鼠气道壁厚度均降低，ECC-BYF Ⅲ组、补气化痰组、扶正化痰组、扶正活血组、补气祛邪组、氨茶碱组大鼠平均气道平滑肌细胞数减少，差异有统计学意义（P<0.05），见表2、图1。
2.2 ECC-BYF Ⅲ及其组分配伍对COPD大鼠血清及BALF气道重塑指标的影响
18组大鼠血清bFGF、血清MMP-12、BALF MMP-12、BALF COL-1、BALF COL-3水平比较，差异有统计学意义（P<0.05）。与正常组比较，模型组大鼠血清bFGF、血清MMP-12、BALF MMP-12、BALF COL-1、BALF COL-3水平均升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，ECC-BYF Ⅲ组、补肾组、补气化痰组、补气活血组、补肾化痰组、补肾活血组血清bFGF水平降低，ECC-BYF Ⅲ组、扶正组血清MMP-12水平降低，ECC-BYF Ⅲ及其组分配伍、氨茶碱组BALF MMP-12、BALF COL-1水平均降低，ECC-BYF Ⅲ组、补肾组、化痰组、活血组、扶正组、补气化痰组、补气活血组、补肾活血组、扶正化痰组、补气祛邪组、补肾祛邪组及氨茶碱组BALF COL-3水平均降低，差异有统计学意义（P<0.05），见表3。
2.3 ECC-BYF Ⅲ及其组分配伍对COPD大鼠气道重塑干预的综合评价
因各组分配伍对各指标效应不同，本研究采用R值综合评价法进行评价。对大鼠血清及BALF中气道重塑相关指标R值综合评价结果显示，除化痰、祛邪、补肾化痰和扶正活血组分配伍外，ECC-BYF Ⅲ及其他组分配伍和氨茶碱组均能不同程度地纠正血清及BALF中气道重塑指标分泌（P<0.05），以补气祛邪、补气活血、扶正化痰组分配伍效果最佳。对COPD大鼠气道壁厚度、气道平滑肌增生情况、血清及BALF中所有气道重塑相关指标（总指标）进行R值综合评价结果显示，除化痰、祛邪组分配伍外，ECC-BYF Ⅲ及其余组分配伍和氨茶碱组均可改善COPD大鼠气道重塑（P<0.05），补气祛邪、扶正化痰、补气活血组分配伍效果较好，见表4。
3 讨论
COPD归属中医“肺胀”“喘病”等范畴，与“肺胀”最为接近。肺脏感邪，迁延失治，痰瘀稽留，损伤正气，肺脾肾三脏虚损，正虚卫外不固，外邪易反复侵袭而诱使本病发作，其主要病机为“正虚积损”，兼痰瘀闭阻［16］。正虚为肺肾气虚、阳虚或阴阳两虚，以肺虚为始、肾虚为基、气虚为本；积损是指痰瘀及其互结成积、日久损伤正气，正气渐损而积损难复。元代朱丹溪之《丹溪心法·咳嗽》曰：“肺胀而咳，或左或右不得眠，此痰夹瘀血碍气而病”，提示肺胀的发生与痰瘀互结，阻碍肺气有关。久病肺脾肾三脏亏虚，痰瘀互结，阻滞气道，使气道涩滞不利，肺气受阻，还于肺间，肺气胀满而失敛降。正虚为痰瘀形成的主要原因，血瘀痰阻，气道涩滞不利则是导致肺气受阻而形成肺胀的基础。这与COPD气道重塑引起气道狭窄、阻塞，进一步导致气流受限的机理一致。因此，可以认为COPD气道重塑的病机为久病正气虚损，痰瘀互结，阻塞气道，气道涩滞不利，即正虚血瘀痰阻。肺肾气虚证兼见痰瘀是COPD稳定期主要证候，补肺益肾佐以化痰祛瘀是其主要治则。ECC-BYF Ⅲ是在补肺益肾方的基础上优化筛选形成的，课题组前期动物实验研究结果显示，ECC-BYF Ⅲ可显著改善COPD大鼠肺功能，抑制炎症反应［17-18］，减轻气道重塑［13］。本研究旨在探讨ECC-BYF Ⅲ对COPD气道重塑干预作用的配伍规律。
COPD的主要特征为不可逆性气道重塑和气流受限，气道重塑是发生气流受限的主要病理基础，在COPD 的形成和发展过程中有重要地位。COPD患者气道管壁增厚变形，以平滑肌增厚最为显著，导致气道管腔狭窄和气流阻力增加。气道重塑主要表现为气道壁增厚、气道平滑肌细胞增殖及细胞外基质沉积。在COPD气道重塑中，小气道平滑肌细胞增生肥大，数目显著增多，变化突出［19-20］。本研究结果显示，模型组大鼠气道壁明显增厚，气道平滑肌细胞显著增多，说明香烟烟雾暴露联合反复细菌感染的方法诱导的COPD大鼠存在气道重塑。ECC-BYF Ⅲ干预组大鼠气道壁厚度较模型组明显变薄，气道平滑肌细胞数减少，提示ECC-BYF Ⅲ对COPD气道重塑有显著纠正作用。
COPD气道重塑是损伤/修复的反复过程，机制复杂，涉及多种因子和多个环节。bFGF是具有较强丝裂原活性的多肽分子，可促进平滑肌细胞、成纤维细胞及血管内皮细胞等生长、增殖和分化，并趋化成纤维细胞、内皮细胞参与损伤组织的重建和修复［21-22］。bFGF还能激活成纤维细胞，使胶原合成增加并堆积于气道壁和血管壁细胞外基质中，加重气道重塑。血清bFGF的表达与COPD急性加重期患者气道阻塞程度密切相关［23］。基质金属蛋白酶（MMPs）可降解细胞外基质和基底膜的多种蛋白成分，参与气道重塑。在香烟烟雾、细菌等刺激下，MMPs分泌增多，降解细胞外基质中的胶原蛋白，破坏细胞外基质成分，促进细胞外基质沉积，加速气道重塑［24-25］。本研究结果显示，COPD大鼠血清中bFGF、MMP-12水平显著升高，且BALF中MMP-12、COL-1、COL-3水平显著升高。这可能与bFGF的高表达促进胶原蛋白的合成与沉积有关。bFGF高表达加重气道平滑肌细胞的增生，平滑肌细胞收缩使管腔狭窄，细胞外基质过度沉积限制了管腔扩张，共同促进COPD气道重塑。ECC-BYF Ⅲ干预组大鼠bFGF、MMP-12、COL-1、COL-3水平均显著降低，提示ECC-BYF Ⅲ对COPD气道重塑的干预作用可能与调节bFGF、MMP-12分泌、减轻细胞外基质沉积有关。
为了探讨ECC-BYF Ⅲ组分配伍对COPD气道重塑的配伍规律，本研究还检测了不同组分配伍对气道重塑相关指标的影响，结果显示不同组分配伍对相关指标有不同的影响。R值综合评价发现，在对大鼠血清及BALF中气道重塑相关的影响方面，除化痰、祛邪、补肾化痰和扶正活血组分配伍外，ECC-BYF Ⅲ及其他组分配伍均能不同程度地纠正血清及BALF中气道重塑指标分泌，以补气祛邪、补气活血、扶正化痰效果最佳。对所有指标进行R值综合评价，结果显示，除化痰、祛邪外，余组分配伍可显著纠正COPD大鼠气道重塑，作用较强的为补气祛邪、扶正化痰、补气活血组分配伍。补气祛邪、扶正化痰、补气活血组分配伍均含补气类组分人参皂苷Rh1和黄芪甲苷。因此，可以认为含补气类组分（人参皂苷Rh1和黄芪甲苷）的配伍对COPD大鼠气道重塑有较好的纠正作用。
综上所述，ECC-BYF Ⅲ中不同组分配伍对COPD气道重塑指标有不同的作用，含补气类（人参皂苷Rh1和黄芪甲苷）的组分配伍对COPD大鼠气道重塑有较好的纠正作用，但其作用机制有待于进一步研究。本研究基于ECC-BYF Ⅲ的良好疗效，评价不同组分配伍对COPD大鼠气道重塑的干预特点，为组分方的配伍规律及优化治法研究提供思路。但是，COPD气道重塑机制较复杂，本研究仅从体内实验评价ECC-BYF Ⅲ不同组分配伍对COPD气道重塑的配伍规律，后续研究需要基于体外模型，评价其疗效特点，深入探讨机制，为补肺益肾组分方的临床应用及新药研发提供基础。
参考文献略
最后编辑于 2024-08-20 · 浏览 1312
