分析方法开发

一、有关物质

有关物质方法是最令分析工作者头痛的环节，有的药品多达数十个杂质，我见过最多的有三十多个，如何高效地建立分析方法，的确很反映分析工作者的水平，鄙人建议从以下思路来考虑：

1. 搞明白特定杂质：查阅文献，包括药典、质量标准，搞清楚控制杂质是什么，使用的柱子是什么，如果没有药典、质量标准，可以查阅FDA/PMDA的审评综述，寻找蛛丝马迹，当然也可以查阅一些学术论文，寻找蛛丝马迹，正所谓磨刀不误砍柴工，或多或少会有收获的。
2. 弄清楚潜在杂质：一般上市药品，TLC pharmchem和TRC之类的网站，往往能查到一系列的潜在杂质，如这些网站的杂质不全，可以通过合成路线和降解路线，找出工艺杂质和降解杂质，理论存在的杂质有哪些？哪些杂质是可以通过起始物料控制，哪些杂质是可以通过中间体控制等等。
3. 根据化合物和杂质的结构特征选择柱子。当然如果有文献能查到柱子，可以优先选择，如无文献支持，可以通过柱子选择一般原则选择柱子，首选C18柱，因为C18可以实现80%以上的化合物分析，如化合物或杂质中芳香环较多，可优选苯基柱，依次类推，按照需要，选择恰当的柱子。确定柱子的型号后，还可以对比不同品牌柱子的分离效果进行优化，此外合理选择色谱柱填料的粒径可以得到更高的分离度，合理选择柱子长短，可以有效地节省分析时间，可参见液相色谱柱的选择，篇幅有限，不再一一列举。
4. 流动相选择：对于反相系统，选择流动相的一般思路是乙腈-水，或甲醇-水，优选在近中性的系统进行等度或梯度洗脱。但是很多化合物解离性比较强，在PKa相近PH值的流动相中会解离而出现双峰，因此一般选择PH＞PKa±2的流动相系统。因为填料裸露硅醇基的影响，碱性环境往往会引起拖尾，所以尽量选择酸性环境，特殊的情况下还需要加入扫尾剂。除了扫尾剂，控制缓冲盐浓度也是一个解决色谱峰拖尾问题的措施。对于一些保留不住的化合物，可以考虑流动相中加入表面活性剂进行离子交换，以获得更好的保留时间。
5. 相比乙腈，甲醇有其性价比的优势，但是甲醇活性高，可能与某些样品发生反应，而且甲醇在低波长下有紫外吸收，会降低分析方法的灵敏度；乙腈虽然价格很高，毒性比甲醇大，但是洗脱能力比甲醇强，很少与样品发生反应，用作流动相系统压力要比甲醇低很多。此外，在甲醇、乙腈分离效果不好之时，可以添加少量四氢呋喃，以改善分离度。流动相优化则主要在水相上下功夫，水里可以加酸、加碱、加盐，从而改善峰形、提高分离度。流动相里加碱的情况比较少，因为一般柱子耐酸不耐碱。常用的酸有磷酸、三氟乙酸、甲酸、乙酸、高氯酸、甲基磺酸等，其中最常用的是磷酸和三氟乙酸，磷酸在低波长下没有紫外吸收，而三氟乙酸在低波长下有，所以普通HPLC，低波长下磷酸最合适，三氟乙酸有吸收，运行梯度时基线漂移很严重，不过三氟乙酸酸性较强用量可以很少，而且可以同时加入到水相和有机相里。对于加盐，一般是缓冲对，加缓冲对不仅可以调整流动相PH，还能优化峰形。
6. 检测波长选择：初步开发方法时最好使用DAD检测器，使用全波段扫描，一是更容易获得全面的杂质数据，二是可以通过峰纯度来判断是否主峰包杂质，如果担心DAD检测器精度偏低，可以适度提高进样量，一般3倍左右即可，进样量过大会引起柱子过饱和而导致色谱峰拖尾或前延。如没有DAD检测器，则可以使用紫外扫描，选择杂质的最佳折中波长。
7. 梯度选择：因为色谱分离系统多为相似相容原理，只要流动相系统一确定，如不改变PH值，出峰顺序也就确定了，因此各化合物的出峰顺序是可以根据极性进行预测的，我一贯的做法是使用Chemdraw计算logP和查询Pka数据，一般情况下八九不离十。建立梯度，一般是有机相从低到高，可以通过积分法计算有机溶剂量来筛选梯度。一般情况下，尽管梯度不同，但化合物的出峰时间是与有机溶剂泵出量相关的。如色谱峰与梯度峰发生重叠，可以是进样开始时加一段时间的等度，就可以把梯度法错开了。

1. 
   
2. 
   
3. 流速和柱温选择：对于普通柱子，选择1-1.5ml/min的流速比较理想，对于UPLC柱子，一般0.3-0.5ml/min的流速。某些色谱条件，柱温可能对分离效果有影响，因此可能还需要进行柱温筛选。现在的液相一般都带控温室，可以筛选一个最佳的柱温。
4. 样品前处理：溶样溶剂往往也会影响分离效果，溶解性不好，可能导致部分杂质无法检出，溶解性过强，则可能引起保留时间较短的色谱峰变形，有的溶剂还会有溶剂峰干扰色谱峰。此外，滤膜、注射器往往会引入杂峰，干扰分析，开发方法学时要注意。

1. 
   
2. 
   
3. 合理调整分析方法学的区分度：对于起始物料或中间体上就可以控制，而且理论上反应中不会再次生成的杂质，就无需加到终产品的标准里。对于有些含量极少，两个和三个色谱峰叠加，按最大校正因子计算后含量仍低于0.05%，且不属于降解杂质和基因毒杂质的，也就没必要去分离了。因此如何把握尺度，还需要具体问题具体分析，没有必要一一分开。如果原料药做的足够好，可以把所有杂质都控制在0.05%以下，质量标准定个等度方法又何妨？

有关物质开发难度比较大，如何去把握尺度，高效的进行方法学开发，反映的是分析工作者的水平。

二、含量

搞定了有关物质，含量方法学就显得比较小儿科了。很多时候，可以把有关物质方法稍微调整一下，就搞定了，甚至原封不动的搬过来直接用。不过含量方法与有关物质方法的开发目的是不一样的。含量检测的对象是API，有关物质检测的对象是杂质。含量方法只要求API主峰与杂质峰不重叠，峰纯度合格，峰性指标合格即可，检测时间越短越好，条件越简单越好。当然，这里的检测波长一般选择API的最大波长或最佳波长，而不是杂质的折中波长。此外，含量还需要开发一种滴定方法，可以根据化合物特征选择滴定液和指示剂即可。

三、手性

其实鄙人一直认为，手性方法是最容易开发的方法，难点是柱子的选择。其实仿药一般都能查到相应的文献，查几篇文献，使用文献里的柱子试试就差不多了。手性检测所需分离的物质一般也就一对到两对，可变化的流动相范围也不大，所以不是很难，而且色谱柱供应商还可以提高方法开发。

四、残留溶剂

残留溶剂一般使用气相检测，气相色谱柱就那么几种，载气也就是那么几种，而且每种残留溶剂都能查到对应的文献，选择恰当的色谱柱，恰当控制模块间的温度或升温程序基本就可以解决。

五、溶出

溶出方法的开发包括两个部分，一个部分是溶出试验方法，一个是溶出样品检测方法。溶出试验方法的方法开发可以查文献，根据原料药的溶解度实验来筛选介质，或者需要加表面活性剂等，还需要和制剂沟通，因为只有制剂工作者才能根据生物药剂学特性合理把握方法学的区分尺度。检测方法由分析的搞定，如果含量方法时间够短，可以使用含量方法直接测定溶出，如果含量方法检测时间较长，可以换成短柱子，进一步缩短检样时间。如果有UPLC，那是最好不过，一般3min就可以搞定一针。在有些情况下，溶出液可能不稳定或者要稀释，分析工作者应开发一个合理的样品前处理方法。

六、粒度

粒度检测的结果只要符合药典指标即可，即制备6个平行样品，连续测定，D50的RSD值应小于10%，D90和D10的RSD应小于15%，小于10μm的参数翻倍，即20%和30%。此外，一般方法学的准确度要求都是误差不超过2%，因此单个测定结果残差也不应超过2%。粒度方法的开发一般比较简单，可以按以下思路进行开发（此处只介绍湿法）：

1. 查阅文献，一般是专利，尽量找到待测化合物的折光率，如文献无法查到，就需要自己测定。如急用数据，可以使用仪器默认的通用折光率进行测定，不过方法学验证时，一定要测定出来，不然数据可能不被认可，因为很多情况下折光率是影响测定结果的。
2. 选择介质，介质一般选择不良溶剂作为测定介质。如果没有合适的不良溶剂，可以使用API进行预饱和，然后抽滤即可。如果API的溶解度不大，对溶剂的折射率不造成显著的影响。如颗粒结团、漂浮，可以在介质中加少量的表面活性剂，比如吐温、磷脂等，一般万分之一到千分之一就够了。
3. 样品前处理，最好6个样品前处理好，条件一定要平行，均匀地分散在测定介质中，如需要搅拌和超声，搅拌和超声的强度切勿过强，以免打碎颗粒，得不到真实的结果。
4. 选择测定条件，搅拌和超声的强度也要进行筛选，选择合理的条件。测定时应按照仪器SOP操作，包括清洗、扣背景、遮光率等等。平行测定6个样品，如6个样品的的结果残差均低于2%，且能满足标准：D50的RSD值应小于10%，D90和D10的RSD应小于15%，小于10μm的参数翻倍，那么测定数据可以认定为准确的。当然了残差越小越好，很多时候可以达到1%以下。