[求助]细胞免疫荧光染色实验

本人目前在做肺成纤维细胞的53BP1免疫荧光染色表征DNA损伤，由于被要求硬跨专业所以基本没有相关基础，加上身边包括导师也都完全不是这个方向所以没法指导，完全是根据文献和网上资料拼拼凑凑得出的实验方案，

摸索了几次之后做出来的图显示（图二-图五），不仅整个细胞都浅浅地染上了DAPI核染色的蓝色荧光，本来应该出现在细胞核里的绿色荧光（53BP1）也整个细胞都是，核里几乎没有，甚至细胞外都有！！！求求各位老师指导一下该怎么调整实验？万分感激！！（理想结果是蓝色荧光的细胞核中有清晰的绿色荧光点，如图一所示）

图一

操作：（48孔板＋细胞爬片）

①37℃（仅此处） PBS室温静置洗3次×3 min，4%多聚甲醛室温静置30 min。

②PBS室温静置洗3次×5 min，加入PBS 4℃暂时保存几十分钟待用。

③碧云天免疫染色通透液(Triton X-100)摇床室温20 min。

④PBS室温摇床洗3次×5 min，10%山羊血清/PBS摇床室温90 min。

⑤兔抗53BP1（1 mg/mL）：碧云天免疫染色一抗稀释液=1：500，4℃静置过夜，parafilm封口膜密封避免水分挥发。

⑥PBS室温摇床洗3次×10 min，碧云天Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG(H+L)抗体：免疫荧光染色二抗稀释液=1：1000，摇床室温避光1 h。

⑦PBS室温摇床洗3次×10 min，1.25 μg/mL DAPI摇床室温避光3 min。

⑧PBS室温摇床洗3次×10 min，碧云天抗荧光淬灭封片液封片，期间避免干片。

共聚焦图像如下（图二-图五）：（未进行任何图像处理）

图二

图三

图四

图五