293T复苏后传代全飘

最近复苏293T出现无法 传代的情况，即复苏出来至培养瓶24h观察能贴壁，但一传代或铺板，细胞全飘、较多聚团 ，但背景较干净并无很多黑点。

和实验室其他同事以及细胞售后技术讨论后，认为是细胞冻存密度过高、冻存液不能实现有效保护，导致细胞冻存时有损伤无法耐受传代。

问题：冻存时一个T75约80%-95%，冻存至1ml商品化无血清冻存液【以前也用同款冻存液成功冻存过很多，当时没考虑过严格关注冻存过密的问题；其他细胞这样冻也没什么问题，可能293T细胞本身也更脆弱】。由于冻存细胞得不到足够冻存液的保护，存在冻存损伤。复苏后部分细胞已死亡，其他细胞可能团聚周围（技术解释的），不利于良好地铺展、生长。

建议的解决办法：

（1）一个T75根据密度冻存至2-3个冻存管，每管1ml上述冻存液（当然也根据经验和细胞有无叠层，适当调整）

（2）复苏时若密度较低，可以在T25先复苏（因为冻存后的细胞皱缩，低密度不利于生长）。【实验室有其他同学冻存时一个T25冻2-3管，使用自制冻存液（纯血清+DMSO）也生长良好，可见冻存液保护效能确实很重要】

（3）若复苏传代后遭遇上述同样问题，只要看到培养基背景不脏（没有很多黑点），可以尝试漂浮细胞再稳定1天，然后收集上清、吹打均匀，重新换10%FBS高糖DMEM培养基铺板，然后再观察1-2天细胞铺板情况看能否抢救回来。技术说更高浓度的FBS比如20%可能没有必要，但如果想尝试可以用12-15%的FBS。【这个办法暂时还没试过，不知道效果，提供给大家参考】。

不知道大家还有没有什么经验，一起分享一下。