怎样分离原代的肺动脉平滑肌细胞呢？

1.酶消化法

1.取清洁级雄性SD大鼠90g，颈椎脱臼法处死（一手置于大鼠颈部，另一只手捏住大鼠尾根部，垂直向上猛提，以达到脱臼的目的）。

2.处死后将大鼠整体置于盛有75%酒精中5min。

3.取出后，置于超净工作台中，剪开胸腔，暴露心肺组织，将心肺一同剪下后置于预先预冷的平皿，皿中盛有含1%双抗的PBS溶液，漂洗2-3次后，除去心脏和肺门周围组织，换另一皿继续操作（皿中溶液同前）。

4.沿着肺血管走形，剥除肺动脉血管周围组织，将分离出的肺动脉移至无血清高糖DMEM中，纵向剪开血管，用弯镊轻轻刮除内膜和外模，留中膜平滑肌组织层。以上均在冰上操作，超净工作台不打开酒精灯。

5.将刮去内膜和外膜的肺动脉，剪成适当大小（约1mm*1mm），移至15ml离心管中，加入 3 ml II型胶原酶消化液( 0.2%,用纯DMEM或含20%胎牛血清DMEM均可配置),实验验证，用20%胎牛血清DMEM配置0.2% II型胶原酶消化液效果好，在CO2培养箱或37℃水浴静置消化 2小时左右，期间每隔30min吹打一次，见组织边缘呈絮状，弃上层消化液，留消化后的平滑肌组织，加入5 ml 含20% 胎牛血清的DMEM 培养基（根据接种培养瓶或培养皿的大小加入相应体积的完全培养基量），用1 ml 移液器上下吹吸 20 次，制成细胞悬液接种于培养瓶中，于5% CO2 培养箱 37℃ 培养。常规换液，倒置相差显微镜下观察。

注：在高糖DMEM中剪肺动脉后不好移至胶原酶消化液，可直接将胶原酶消化液倒入干净培养皿中，在消化液中剪成1mm*1mm后用吸管吸入15ml离心管中进行消化。

6. 2天后换液，倒置显微镜下观察可见平滑肌细胞已贴壁。

酶消化法后2天倒置显微镜下所见。