脏痹方治疗类风湿关节炎间质性肺疾病小鼠关节炎及肺脏并发症的疗效研究
类风湿关节炎（RA）是一种常见的以炎性关节炎和系统性并发症为特征的自身免疫性疾病［1］。间质性肺疾病（ILD）是RA患者严重的关节外表现之一，被认为是RA患者仅次于心血管疾病的第二大死亡原因［2］。据报道，60%~80%的RA患者在一定程度上可发生肺受累［3-4］，2%~10%的RA患者会发生临床显著的ILD［5］。一项队列研究报道，RA患者并发ILD导致过早死亡的风险约增加了3倍［6］。ILD不仅严重影响RA患者的生活质量，同时显著降低患者的生存率［7］，已成为各国日益关注并急需解决的公共卫生问题。
临床上对类风湿关节炎间质性肺疾病（RA-ILD）仍然没有明确的治疗指南，以经验治疗为主。临床常用的药物主要是糖皮质激素和免疫抑制剂［8］。然而以上药物并不能达到长期的治疗效果，反而会增加感染风险［9］。此外，常使用的RA治疗药物如抗风湿类药物和非甾体抗炎药等，虽然可以有效缓解关节炎症，但对RA-ILD并不能起到很好的治疗作用，甚至会促进RA-ILD进展［10-11］。因此开发可以同时改善RA患者关节炎症和肺部病变的药物，对于更有效地减轻患者临床症状，提升生活质量甚至延长寿命具有重要意义。
在中医学者，《素问·痹论》曰：“皮痹不已，复感于邪，内舍于肺，是为肺痹。……凡痹之客五脏者，肺痹者，烦满喘而呕。……淫气喘息，痹聚在肺，……其入脏者死”。尽管在中医理论中没有RA-ILD的病名，但根据其临床表现可归属于中医学中的肺痹范畴。国医大师施杞教授传承石氏伤科“以气为主，以血为先”的治伤理念为RA内脏并发症患者研究制成脏痹方，该方由生黄芪、当归、柴胡、秦艽、仙鹤草、仙灵脾、延胡索和川牛膝组成，具有益气活血、祛风除湿、通痹止痛的功效。临床上常用该方治疗正气亏虚，瘀血挟风湿，经络痹阻，肩痛、臂痛、腰腿痛或周身疼痛，经久不愈者，但其作用机制以及对内脏并发症的疗效仍不清楚。目前尚无脏痹方治疗RA及其内脏并发症的实验室研究，本研究团队采用肿瘤坏死因子α（TNF-α）转基因（TNF-Tg）小鼠作为RA和RA-ILD的模型，探讨脏痹方对RA和RA-ILD的作用及作用机制。
1 材料与方法
1.1 研究时间
2022年1月—2023年3月。
1.2 实验动物
实验所用C57BL/6背景的3647系雌性TNF-Tg小鼠，最初由KEFFER等［12］获得，后由美国罗切斯特大学邢联平教授赠送。该系TNF-Tg小鼠携带一份人类TNF基因拷贝，过表达人类TNF-α，并通过与C57BL/6小鼠回交维持为杂合子，非转基因同窝产仔被用作野生型对照。本研究使用14只2.5月龄雌性TNF-Tg小鼠和7只同窝野生型小鼠。实验动物均在赛业（苏州）生物科技有限公司繁殖，动物许可证号为SCXK（苏）2018-0003。动物饲养环境为SPF级，饲料饮水正常提供，控温恒湿，光照/黑暗（12 h/12 h）循环照明。本实验经赛业（苏州）生物科技有限公司动物伦理委员会批准（ACU22-0056）。操作均按照中国国家科学技术委员会动物法规批准的《医学实验动物管理实施细则》［13］进行。
1.3 实验仪器
组织全自动脱水机、组织包埋机、石蜡切片机、冰冻切片机（德国Leica公司，型号：ASP300 S，EG1150、RM2125 RTS、CM3050 S）；组织全片扫描仪（Olympus，型号：VS120）；电子天平（赛多利斯公司，型号：Cubis®）。
1.4 主要试剂
多聚甲醛、无水乙醇［生工生物工程（上海）股份有限公司，货号：A500684、A500737］；二甲苯、盐酸、氨水、乙二胺四乙酸（EDTA）、无水冰醋酸钠、亚硝酸钠（中国医药集团有限公司，货号：20140506、20140228、20140607、10009617、10018818、10020018），苏木素、伊红、阿尔新蓝、1%电泳级橙黄G溶液、Phloxin B、硫酸铝铵、碘酸钠、L-酒石酸、萘酚AS-BI磷酸盐（sigma，货号：H-3136、E4009-5G、A5268、1936-15-8、18472-87-2、A-2140、S-4007、251380、1919-91-1），CD3、山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor® 594）（Abcam，货号：ab33429、ab150080），B220 Alexa Fluor®488（eBioscience，货号：4292077），Masson试剂盒（索莱宝，货号：G1340），牛血清白蛋白（Roche，货号：10735078001），抗荧光淬灭封片液（含4'，6-二脒基-2-苯基吲哚）（碧云天，货号：P0131）。
1.5 脏痹方煎剂的制备
生黄芪18 g、当归12 g、柴胡9 g、秦艽9 g、延胡索6 g、川牛膝12 g、仙鹤草12 g、仙灵脾12 g，所有中药从上海中医药大学附属龙华医院采购。将小鼠（20 g）与人（70 kg）的中药剂量按照换算系数9.01进行换算［14］，得到小鼠的脏痹方给药剂量为13.65 g/kg。
取上述5剂，加入12倍水（5 400 mL）先浸泡30 min，煎煮30 min后将药物溶液过滤，所剩药渣加8倍体积的水（3 600 mL）再煮30 min，过滤得到滤液。将两次所得的滤液混合，在通风橱内加热浓缩至321 mL，得到脏痹方煎剂（1.4 g/mL），分装储存于-80 ℃冰箱备用。
1.6 分组与给药
将14只TNF-Tg小鼠按体质量随机分为2组：生理盐水组（Saline组）、脏痹方组（ZBF组），每组各7只。同时随机挑选7只同窝WT小鼠作为对照组（WT组）。适应性喂养1周后开始灌胃。ZBF组给予脏痹方（1.4 g/mL），灌胃1次/d，0.2 mL/次，WT组和Saline组小鼠给予等量0.9%氯化钠溶液灌胃，连续8周。灌胃结束后处死所有小鼠。
1.7 标本处理与指标检测
1.7.1 标本处理：小鼠处死后取踝关节（保留完整关节囊）和肺脏，室温下多聚甲醛中固定24 h，踝关节标本10% EDTA脱钙4周，每72 h更换脱钙液1次，组织脱水，石蜡包埋。小鼠左肺脱水，进行石蜡包埋，右肺蔗糖梯度脱水，进行冰冻包埋。石蜡包埋后的关节和肺脏经4 μm矢状位连续切片，冰冻包埋后的肺脏经7 μm矢状位连续切片。
1.7.2 苏木素-伊红（HE）染色：关节和肺脏组织的石蜡切片脱蜡至水，依次进行苏木素染色5 min，盐酸乙醇分化10 s，氨水返15 s，伊红染色10 min，乙醇脱水，二甲苯透明，封片。使用组织全片扫描仪采片观察到细胞质和细胞外基质染为红色，细胞核染为蓝色，并使用Image J软件通过细胞核形态来计算炎性细胞面积。
1.7.3 阿尔新蓝-橙黄染色：关节组织的石蜡切片脱蜡至水，依次进行盐酸乙醇分化30 s，艾尔新蓝染色40 min，2%盐酸乙醇分化5 s，0.5%氨水返蓝，橙黄染色1 min，乙醇脱水，二甲苯透明，封片。使用组织全片扫描仪进行采片，并使用Image-pro plus 5.1软件测量骨与软骨面积。
1.7.4 抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色：基础液（含0.92%无水乙酸钠、1.14%酒石酸、0.28%冰乙酸）37 ℃烤箱预热2 h，关节石蜡切片脱蜡，切片置于孵育液（50 mL基础液加0.5 mL萘酚AS-BI磷酸盐）37 ℃孵育1 h，于另一缸孵育液（基础液加4%亚硝酸钠水溶液、品红）37 ℃孵育1 h，苏木素复染2 min，盐酸乙醇分化10 s，氨水返蓝15 s，脱水透明，封片。使用组织全片扫描仪采片，并使用Image-pro plus 5.1软件测量破骨细胞面积。
1.7.5 Masson染色：肺组织的石蜡切片脱蜡至水，按照试剂盒说明书步骤进行操作并使用组织全片扫描仪采片，根据Ashcroft肺纤维化评分［15］进行数据分析。
1.7.6 免疫荧光染色：冰冻肺组织切片复温，5% BSA封闭液室温封闭1 h，一抗（CD3和B220均以1∶1 000比例稀释）混合液4 ℃过夜。磷酸缓冲盐溶液（PBS）浸洗3次，5 min/次。山羊抗兔IgG H&L（1∶400比例稀释）混合液避光室温孵育2 h。PBS浸洗3次，5 min/次。荧光封片剂封片。使用组织全片扫描仪（荧光模式）采片观察B淋巴细胞和T淋巴细胞分布情况，并进行统计分析。
1.8 统计学方法
使用SPSS 25.0统计学软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料以（x±s）表示，若方差齐，多组间比较采用单因素方差分析，两组间采用LSD-t检验，若方差不齐采用非参数检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 3组小鼠踝关节病理染色结果
HE染色结果示，WT组小鼠踝关节正常完整，无滑膜炎症；Saline组小鼠的踝关节内炎性细胞浸润明显增多，滑膜增生，关节组织被破坏。ZBF组踝关节的炎症减轻。3组小鼠踝关节炎性细胞面积占比比较，差异有统计学意义（P<0.05），其中Saline组高于ZBF组、WT组，ZBF组高于WT组（P<0.05），见表1、图1。
阿尔新蓝-橙黄染色结果示，Saline组小鼠踝关节距骨矢状面被严重破坏，骨侵蚀严重，ZBF组小鼠踝关节骨与软骨侵蚀明显改善，距骨矢状面轮廓逐渐清晰，骨量明显增加。3组小鼠踝关节软骨面积、骨面积占比比较，差异有统计学意义（P<0.05），其中Saline组软骨面积、骨面积占比低于ZBF组、WT组，ZBF组软骨面积、骨面积占比低于WT组（P<0.05），见表1、图2。
TRAP染色结果示，Saline组小鼠踝关节中出现大片红色破骨细胞浸润，ZBF组小鼠破骨细胞浸润情况明显改善。ZBF组破骨细胞面积明显低于Saline组（P<0.05），见表1、图3。
2.2 3组小鼠肺组织病理染色结果
HE染色结果示，WT组小鼠肺脏结构清晰，肺组织无病理性损伤；Saline组小鼠肺间质、血管和支气管周围弥漫有轻度至中度的炎性细胞浸润，中、小动脉壁增厚，肺泡间隔缩小，肺组织破坏明显；ZBF组小鼠肺间质和气管血管周围的炎性细胞减少，肺组织渐清晰，结构得到改善。3组小鼠肺组织炎性细胞面积占比比较，差异有统计学意义（P<0.05），其中Saline组高于ZBF组、WT组，ZBF组高于WT组（P<0.05），见表2、图4。
Masson染色结果示，Saline组小鼠肺组织中血管和气管周围蓝色胶原纤维面积明显增多，肺泡或支气管壁增厚，ZBF组肺脏血管和支气管周围蓝色胶原纤维面积减少，肺脏结构改善明显。3组小鼠肺组织纤维化评分比较，差异有统计学意义（P<0.05），其中Saline组高于ZBF组、WT组，ZBF组高于WT组，见表2、图5。
免疫荧光染色结果示，WT组小鼠肺组织中可见有少量CD3+T淋巴细胞、B220+B淋巴细胞分布。Saline组小鼠肺组织T淋巴细胞、B淋巴细胞明显增多，大多围绕在肺脏血管和支气管周围，形成缺乏生发中心的卵泡样结构。ZBF组小鼠肺脏中的卵泡样结构减少。3组小鼠B淋巴细胞面积占比、T淋巴细胞面积占比比较，差异有统计学意义（P<0.05），其中Saline组B淋巴细胞面积占比、T淋巴细胞面积占比高于ZBF组、WT组，ZBF组B淋巴细胞面积占比、T淋巴细胞面积占比高于WT组，见表2、图6~7。
3 讨论
本研究探讨了脏痹方对TNF-Tg小鼠踝关节炎症和肺脏并发症的治疗效果和潜在机制，实验结果表明，脏痹方减轻了TNF-Tg小鼠踝关节炎症，缓解了软骨损伤与骨侵蚀，减少了踝关节中破骨细胞数目。此外，脏痹方也减轻了TNF-Tg小鼠的肺组织炎症，缩小了肺泡间隔，减少了TNF-Tg小鼠肺脏血管和支气管周围增多的胶原纤维面积，改善了肺组织纤维化程度。表明脏痹方可能会成为临床中治疗RA及其肺脏并发症的潜在药物。
本研究采用雌性3647系TNF-Tg小鼠作为RA-ILD的模型，与免疫刺激物如佐剂［16］、Ⅱ型胶原蛋白［17］等诱导的具有疾病自限性的RA‐ILD动物模型不同，TNF-Tg小鼠模拟了关节与肺脏的进展性慢性炎症及肺纤维化状态，其在2月龄左右开始出现肿胀的脚踝关节，并在3月龄时在无任何刺激的情况下发展为炎症性侵蚀性关节炎［18-19］；除了关节症状外，TNF-Tg小鼠还并发有肺脏的间质细胞浸润、肺泡间隔增厚、血管周围和细支气管周围炎症浸润［20］，流式细胞术显示肺组织中CD11b+/CD11c+双阳性细胞显著增加，同时伴有其他单核细胞和树突细胞数量的增加，且随着月龄增加和关节病变逐渐加重，肺脏病变也逐渐加重［21］。本研究发现TNF-Tg小鼠肺脏中胶原纤维面积增多，出现轻度纤维化情况，肺间质中B220+B淋巴细胞和CD3+T淋巴细胞也明显增多，在支气管和血管周围存在明显增多的B淋巴细胞滤泡结构。在RA-ILD患者肺活检组织的研究中，检测到RA患者肺组织中明显增生的滤泡B淋巴细胞，且几乎完全聚集在细支气管周围［22］，肺组织中CD3+T淋巴细胞和CD4+T淋巴细胞数量显著增加［23］。本研究结果与既往研究一致。TNF-Tg小鼠高度模拟了RA-ILD患者的病理改变，用于药物治疗效果的研究是合适的。
本研究发现TNF-Tg小鼠踝关节出现滑膜炎症浸润，软骨与骨组织丢失，破骨细胞数目增多。这可能与细胞因子和趋化因子通过激活内皮细胞，吸引免疫细胞积聚在滑膜腔室，和破骨细胞之间相互复杂作用，诱导或加重炎症反应，从而导致滑膜肿胀及软骨损伤和骨侵蚀有关［24］。RA相关肺部疾病的病理生理学尚不明确，已有病理学家认识到，RA患者的肺部病理特征包括淋巴细胞聚集物和有组织的淋巴组织区域［25］。早在RA伴发肺部疾病患者的肺组织中就发现了支气管相关淋巴组织（BALT）的存在，最近发现BALT与组织损伤的严重程度相关［25-26］。有研究假设异位淋巴组织可能通过提供T淋巴细胞暴露于B淋巴细胞增加的区域来传播自身免疫，关节炎的滑膜结构为淋巴组织的发育提供了理想的环境［27-28］。在H-L-g7xK小鼠中，B淋巴细胞和抗原特异性B淋巴细胞频率的增加可能是异位淋巴组织的诱导物，B淋巴细胞可以为异位淋巴组织的形成提供必要的趋化因子和细胞因子［29］。在K/BxN小鼠模型中，肺中出现淋巴细胞浸润，且抗原特异性T淋巴细胞和B淋巴细胞的合作活性发展为肺中的异位淋巴组织［30］。本研究结果与之相似，但对于TNF-Tg小鼠肺脏中升高的B淋巴细胞和T淋巴细胞在肺脏病变中发挥的具体机制仍需进一步探究。
脏痹方是国医大师施杞教授为RA经久不愈者所制新方。方中以生黄芪配当归补益脾血，共为君药；仙鹤草入肺、肝、脾经养血，仙灵脾走肝肾二经，为补命门、益精气、强筋骨、补肾壮阳之要药，仙鹤草和仙灵脾补血益肾共为臣药；柴胡和秦艽均归肝胆经，配合发挥疏理肝气、祛风湿、清热、止痹痛的功效，共为佐药；延胡索配川牛膝活血通经为使药。本研究发现，脏痹方不仅减轻了关节炎症，减少了破骨细胞数目，缓解了软骨损伤和骨侵蚀，而且减轻了肺脏炎症和纤维化，降低了肺脏中升高的B淋巴细胞和T淋巴细胞数目，改善了肺组织结构。可知脏痹方在RA和RA-ILD的治疗方面取得了积极的疗效。
本研究中存在一定的局限性：脏痹方虽然可以有效改善TNF-Tg小鼠关节炎症和肺脏损伤，但是其具体发挥作用的化合物成分尚不明确。未来研究将采用高效液相色谱法对脏痹方有效成分进行检测；在实验中设置不同浓度给药组进一步明确脏痹方的药效；并通过网络药理学寻找脏痹方的潜在作用靶点和信号通路，进一步通过分子生物学实验进行验证。
参考文献略
最后编辑于 2024-05-22 · 浏览 807
