miRNA、siRNA、shRNA分不清？看完你就是行家

今天跟大家唠唠RNA中的siRNA、shRNA和miRNA。2000年，《科学》杂志将“重识RNA”选为“十大科技突破”之一，如果说RNA是生物科学研究领域的“明星”，那siRNA、shRNA和miRNA就是“明星”中的“巨星”。

什么是RNA干扰

说起siRNA、shRNA和miRNA就不得不提RNA干扰（RNA interference，RNAi），它是指内源性或外源性双链 RNA（dsRNA）介导的细胞内 mRNA 发生特异性降解，从而导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型缺失的现象。

1998年，Andrew Z. Fire等在实验中发现，单独使用纯化的正义RNA链或者反义RNA，不能导致秀丽隐杆线虫的肌肉抽搐，作为对照加入的双链RNA则具有极强的抽搐效果。加入的双链RNA的抑制效果远强于理论上1:1配对时的反义RNA的抑制效果，这种现象被命名为RNAi。RNA 干涉 (RNAinterference，RNAi) 是，指有效抑制目标基因表达的过程，

2001年“RNA干扰”作为当年最重要的科学研究成果之一，入选《科学》杂志“十大科技突破”；2002年，《科学》杂志将“Small RNA & RNAi”评为2002年度最耀眼的明星。同时，《自然》杂志亦将Small RNA评为年度重大科技成功之一。2003年，小核糖核酸的研究再次入选《科学》“十大科技突破”。2006年，Andrew Z. Fire与Craig C. Mello由于在RNAi机制研究中的贡献而获得诺贝尔生理及医学奖。RNAi现象发现8年后就获得诺贝尔奖，这在诺贝尔生理及医学奖历史上是罕见的。2018年，基于RNAi的基因沉默药物上市，又双叒叕被《科学》评为“十大科技突破”。可以看出，关于RNAi的研究是多么热门而重要，而RNAi研究的主角就是本文要介绍的siRNA、shRNA和miRNA。

回顾RNA干扰发现过程

早在1984年人们就发现反义RNA能够抑制基因的表达，但后来人们发现发现双链RNA在抑制基因表达方面实际上比单链RNA更有效。

RNA干扰现象是1990年由约根森（Jorgensen）研究小组在研究查尔酮合成酶对花青素合成速度的影响时所发现的，为得到颜色更深的矮牵牛花而过量表达查尔酮合成酶，结果意外得到了白色和白紫杂色的矮牵牛花，并且过量表达查尔酮合成酶的矮牵牛花中查尔酮合成酶的浓度比正常矮牵牛花中的浓度低50倍。约根森推测外源转入的编码查尔酮合成酶的基因同时抑制了花中内源查尔酮合成酶基因的表达。

1992年，罗马诺（Romano）和Macino也在粗糙链孢霉中发现了外源导入基因可以抑制具有同源序列的内源基因的表达。

1995年，Guo和Kemphues在线虫中也发现了RNA干扰现象。

1998年，安德鲁·法厄（Andrew Z. Fire）等在秀丽隐杆线虫（C.elegans）中进行反义RNA抑制实验时发现，作为对照加入的双链RNA相比正义或反义RNA显示出了更强的抑制效果。从与靶mRNA的分子量比考虑，加入的双链RNA的抑制效果要强于理论上1:1配对时的抑制效果，因此推测在双链RNA引导的抑制过程中存在某种扩增效应并且有某种酶活性参与其中。并且将这种现象命名为RNA干扰。

Andrew Z. Fire博士（左）和Craig C. Mello博 士（右）

RNA干涉（RNAi）在实验室中是一种强大的实验工具，利用具有同源性的双链RNA（dsRNA）诱导序列特异的目标基因的沉寂，迅速阻断基因活性。siRNA在RNA沉寂通道中起中心作用，是对特定信使RNA（mRNA）进行降解的指导要素。siRNA是RNAi途径中的中间产物，是RNAi发挥效应所必需的因子。 

siRNA 小干扰核糖核酸（small interfering RNA）

指一类长约21-23nt（从文献报道看，19-25nt都是可以的）的双链RNA分子，一般3’端有两个游离的碱基，通过RNA干扰途径沉默目标基因。

siRNA的结构

shRNA 小/短发夹RNA（short hairpin RNA）

是一种依赖茎环序列产生的短双链RNA结构（19-25nt），可利用载体导入细胞当中，在细胞中经酶切形成siRNA，通过RNA干扰途径调控目标基因。

shRNA的结构

miRNA 小分子核糖核酸/微核糖核酸（microRNA）

真核生物中广泛存在的一种长约22nt（21-24nt）的核糖核酸分子，成熟的miRNA为单链RNA，通过降解靶标mRNA或抑制蛋白质翻译调节目标基因的表达。

miRNA的结构

从结构和定义上可以看出，siRNA、shRNA和miRNA的基本异同点主要有3个：

1、三者的成熟体都是长度在20-25nt的小RNA，siRNA是3’端有两个游离的碱基，5’端有磷酸基团的双链RNA，shRNA经过加工形成siRNA，miRNA则最终形成单链RNA。

2、siRNA一般是人工合成的线性双链RNA（dsRNA），shRNA、miRNA则是通过发卡结构形成的局部双链RNA。siRNA和shRNA的双链区是完全互补配对的，而miRNA绝大多数情况下是不完全互补的。

3、从结构上看shRNA和miRNA更相似，事实上shRNA在功能上与siRNA更接近。shRNA在细胞内被Dicer酶切割后形成siRNA，通过siRNA途径行使干扰功能，而miRNA则是通过另一条不同的途径调控目标基因。

他们之间有很多相似之处，特殊情况下甚至可以相互替代，却在RNAi现象中各自发挥着不同的作用，他们之间到底有什么关联和差异，下面就跟大家详细介绍一番。

miRNA与siRNA之间相同之处：

1. 二者的长度都约在22nt左右。

2. 二者都依赖Dicer酶的加工，是Dicer的产物，所以具有Dicer产物的特点。

3. 二者生成都需要Argonaute家族蛋白存在。

4. 二者都是RISC组分，所以其功能界限变得不清晰，如二者在介导沉默机制上有重叠。

5. miRNA和siRNA合成都是由双链的RNA或RNA前体形成的。

miRNA与siRNA的不同点：

1. 根本区别是miRNA是内源的，是生物体的固有因素；而siRNA是人工体外合成的，通过转染进入人体内，是RNA干涉的中间产物。

2. 结构上，miRNA是单链RNA，而siRNA是双链RNA。

3. Dicer酶对二者的加工过程不同，miRNA是不对称加工，miRNA仅是剪切pre-miRNA的一个侧臂，其他部分降解；而siRNA对称地来源于双链RNA的前体的两侧臂。

4. 在作用位置上，miRNA主要作用于靶标基因3′-UTR区，而siRNA可作用于mRNA的任何部位。

5. 在作用方式上，miRNA可抑制靶标基因的翻译，也可以导致靶标基因降解，即在转录水平后和翻译水平起作用，而siRNA一般只能导致靶标基因的降解，即为转录水平后调控。

6. miRNA主要在发育过程中起作用，调节内源基因表达，而siRNA不参与生物生长，是RNAi的产物，原始作用是抑制转座子活性和病毒感染。

shRNA功能与siRNA接近，shRNA在细胞内被Dicer酶切割后形成siRNA，通过siRNA途径行使干扰功能调控目标基因。

虽然siRNA和shRNA都可用于蛋白沉默，但它们的作用机制有所不同（下图）。 不管是长的双链RNA还是短的约21bp碱基对的双链都能够直接被转运到组织培养的细胞中。 虽然有一些报道提到siRNA在转染细胞时是被转运到细胞核中的，但更普遍的看法是它们在细胞质中聚集。

RNAi介导的基因沉默机制

长的双链RNA与Dicer一起形成复合物，双链特异性的核糖核酸酶III能够将它们处理成带有两个游离碱基的长度为21-23nt的siRNA。 随后这些siRNA片段与RISC结合（图1），RISC由Argonaute-2（Ago-2）、Dicer和TAR-RNA-结合蛋白（TRBP）组成。 然后RNA的两条链分开，其中一条链从复合物上分离。 5'端双链稳定性最低的那条链被选择出来，稳定的并入沉默复合物中。

shRNA在转染/转导细胞的细胞核中的合成，形成发夹结构，茎区成对的反义和正义链与未配对的成环核苷酸连接在一起。通过与miRNA的加工相同的RNAi机制，shRNA被加工成siRNA。使用细菌或病毒载体，shRNA被导入靶细胞的细胞核内，在某些情况下，载体可以稳定地整合到基因组中（慢病毒转染会随机整合到靶细胞基因组DNA中，常规转染如PCDNA3.1不整合载体以游离状态存在于靶细胞核内）。根据驱动表达的启动子的不同，shRNA可被RNA聚合酶II（如：CMV，EF1A等）或者RNA聚合酶III（如：U6，H1）催化转录。在被Exportin-5转运到细胞质之前，这些初始的前体结构需要首先用Drosha及其双链RNA结合伴侣DGCR8加工形成pre-shRNA。pre-shRNA随后被Dicer和TRBP/PACT酶切，去除发卡结构，产生在两个3‘末端带有两个游离碱基的20-25nt的双链siRNA。这一有活性的siRNA随后被整合到沉默复合物上去。 

在细胞核表达后，shRNA被Drosha加工然后由Exportin-5蛋白转运到细胞质中，在细胞质中它们与Dicer结合去除环状序列。在这一点上，它们与siRNA的加工方式（以短的双链形态导入细胞，然后被Dicer识别）相同。在与RISC结合并去掉其中一条RNA链后，它们识别mRNA占有互补序列，导致其降解。

一旦被整合到RISC后，shRNA和siRNA识别靶mRNA和降解的过程基本上是相同的。作为RISC的一部分，siRNA通过碱基互补配对以序列特异性的方式结合到靶mRNA，从而利用Ago-2的核酸酶H样活性裂解靶RNA的双链中心附近的磷酸骨架。某些生物的这个系统有一个有趣的特点，siRNA与靶mRNA的退火使siRNA作为引物，而靶mRNA作为依赖于RNA的RNA聚合酶的模板。这就合成出一个新的双链RNA，然后由Dicer酶加工，形成正反馈循环，增加了siRNA的量。应当指出的siRNA通常需要完全同源才能诱导降解。

RNA干扰（RNAi）技术的应用选择

前面已经介绍了三者之间的差别，相信大家可以根据实验目的，判断出选择哪种干扰途径最合适。小艾童鞋把一些建议汇总如下：

1、细胞便于转染或电穿孔转化，研究者关注周期，想快速获得结果，或者想通过荧光分子或其他分子标记检测小RNA，首选siRNA，直接由RNA合成公司合成，推荐选择PAGE及以上的纯化方式；

2、想彻底沉默某一基因且想特异性的沉默某基因，或者想通过诱导在特定时期产生干扰效应，或者想沉默长半衰期的蛋白，或者想获取能稳定遗传的细胞，首选shRNA；

3、植物基因沉默，首选shRNA；

4、基于RNAi的生物性状研究，首选shRNA；

5、内源非编码小RNA调控研究，首选miRNA；

6、想研究一种小RNA对某性状所有调控路径的影响，首选miRNA；

7、靶标基因不能够被完全沉默，否则会导致细胞死亡，首选miRNA；