一文搞定siRNA从原理，引物涉及到细胞转染

1 siRNA背景知识

1.1 siRNA是什么

小干扰RNA (small interfering RNA,siRNA)生物学最重要生物技术之一，是发现能够通过一种被称为RNA干扰(RNA interference, RNAi)的现象来调节基因的表达。siRNA可用作研究体内和体外单基因功能的工具，是一类有吸引力的新型疗法，特别是针对治疗癌症和其他疾病的不可成药靶点。siRNA 递送系统分为非病毒递送系统和病毒递送系统。非病毒递送系统包括聚合物;血脂;肽等是被广泛研究的siRNA递送系统。siRNA的有效药理学使用需要能够将siRNA递送至其预期作用位点的“载体”。载体将 siRNA 组装成超分子复合物，在递送过程中表现出功能特性 [5]。

1.2 RNAi是什么

RNAi是双链 RNA （dsRNA） 通过靶向互补 mRNA 进行降解来诱导基因沉默的生物学机制，是疾病普遍治疗方面的一项巨大创新，并彻底改变了研究人员研究基因功能的方式。RNAi的发现，首先在植物和秀丽隐杆线虫中，后来在哺乳动物细胞中也发现这一种基因调节方式，后来在蛔虫秀丽隐杆线虫中得到证实，秀丽隐杆线虫基因表达能够被被长 dsRNA 下调 [6,7]。

1.3 RNAi干扰机制

RNAi首先将较长的双链 RNA 加工和切割成 siRNA，通常在每条链的 3'末端带有 2 个核苷酸突出端。负责这种加工的酶是一种RNase III样酶，称为Dicer[8-11]。形成后，siRNA与一种称为RNA诱导的沉默复合物（RNAinduced silencing complex, RISC）的多蛋白组分复合物结合[12-15]。在RISC复合物中，siRNA链被分离，具有更稳定的5′末端的链通常被整合到活性RISC复合物中。然后，反义单链siRNA组分引导并排列在靶mRNA上，并通过催化RISC蛋白（Argonaute family（Ago2））的作用，mRNA被切割。

（图1 siRNA介导的RNA干扰通路示意图。具体来说，siRNA的发生分为四个基本步骤。首先，长双链RNA (dsRNA)被核酸内切酶Dicer蛋白加工成小干扰RNA (siRNA)双链；随后，siRNA与Argonaute-2 (AGO2)蛋白结合，该蛋白被认为是称为RNA诱导沉默复合物(RISC)的多蛋白复合物的核心；然后siRNA被分离成两条单链:引导链（Guide strand）和传递链（Passenger strand）；最后，传递链被降解，引导链- RISC复合物结合到互补的靶mRNA触发基因降解。还发现siRNA负载的RISC与核仁区域有关，并且可能通过一个尚未确定的过程进出细胞核 [16-17]。）

2 siRNA引物设计

2.1 siRNA引物涉及遵循基本原则

#1 siRNA靶向位置

一般来说，从靶基因起始密码子AUG下游50～100个核苷酸开始搜寻理想的siRNA序列，越靠近靶基因的3′端，其基因沉默效果可能越好。

# 2 siRNA序列的起始碱基与长度

一般来说，siRNA序列长度在19～29 nt之间，针对具体的序列而言，最好为AA+(N n)UU(N代表任意碱基;n为碱基数目)，其次是 NA(N n) UU和NA(N n) NN。研究表明siRNA在21nt 、27nt、29nt，结果表面21nt相比27nt对靶基因的最大抑制率更容易达到（不过具体的实验，还是应该结合具体的情况而定，因此在设计引物的时候，考虑多种因素，多设计几对是比较ok的）。

# 3 siRNA 3′端突出的dTdT

一般情况下，3′端的2 个碱基使用突出的dTdT（deoxythymidine dinucleotide）取代，能够增强siRNA 双链复合体的稳定性，进而增加siRNA的敲低效率，一般情况下，序列合成公司会自动增加dTdT结构，如果没有提，在设计序列的时候可以咨询一下序列合成公司。

# 4 siRNA序列中G/ C含量的选择

G/C含量在30%～52%的siRNA序列，其沉默基因效果较好。

# 5 .siRNA 序列应避免连续碱基和反向重复序列

一般来说，siRNA序列中连续2个及以上G/C够降低双链RNA内在稳定性，从而降低siRNA在细胞中的敲低效率；而连续3个以上的A和U可能终止由RNA Polymerase III介导的转录作用。siRNA序列中的重复序列或回文结构可能形成发夹状结构，这种结构的存在可以降低siRNA敲低效率。

# 6 siRNA双链的内在稳定性

一般情况下，siRNA的稳定性直接影响其最终在细胞中的敲低效率。在siRNA的反义链5’端第一个碱基尽量可能是为A或U; siRNA正义链的5’端第一个碱基尽量为G或C。

# 7 siRNA 序列的特异性

目前没有研究报道siRNA的干扰效率与mRNA中具体位置的关系，因此，在设计siRNA时候应考虑多条siRNA，siRNA序列保守性，siRNA对应到靶基因的不同位置或在靠近3′端多设计一条，不同序列之间间隔应该在25-30bp之上。

# 8 其它建议

对于新手来说，务必多参考siRNA序列的基本特性；对于老手来说，多次重复失败，那就直接选择包成功的siRNA设计公司吧。不论新手或者老手最终目标都是实现靶基因的敲低，对吧，不管黑豹白猫抓住老鼠就是好猫。

2.2 siRNA序列设计实操

# siRNA设计网站推荐（以DSIR为例）

DSIR网站网站简介

一般情况下各种siRNA设计网站已经成熟，都有自身的设计匹配参数，设计出合适的siRNA序列，DSIR（http://biodev.extra.cea.fr/DSIR/DSIR.html）效果不错。

（图2 DSIR siRNA设计界面展示）

# siRNA设计实操（P53 human为例）

（1）在NCBI查找基因编号和序列

首先在NCBI查找到human P53的基因，然后仔细审阅P53的可变剪接体，尽可能选择各剪接体共享位置和区别于其它基因保守位置。

（图3 NCBI限定检索P53 human设置示意图）

（2）在NCBI中拷贝NM号和CDS序列

通过NCBI检索human P53发现多个可变剪接体，在此以第一条为例，进行siRNA引物设计。需要拷贝的信息：NM_000546.6，然后拷贝CDS区序列即可。

（3）DSIR设置

首先DSIR在“design name”的对话框中必须输入基因编号（来自NCBI）,然后就是“sequence”它要求“FASATA format only”，其实这种格式就是要求在基因序列前边加入“>”（英文状态大于符号）即可，最后点击Run analysis即可。

（图4 DSIR siRNA基本参数简介）

（4）DSIR引物的选择

首先，因siRNA作用的具体位置目前还不确定，因此多一条siRNA就多一分成功，因此，建议至少设计2-3对；其次，一般来说靠近3’端效果可能更好，因此位置也需要考虑进去，此外，正义链的5’端G或C，反义链5’端A或U；最后兼顾DSIR的打分原则。综合上述因素选择合适的3-4对siRAN序列进行序列合成，合成时候使用HPP纯度（也可以直接告诉序列合成公司，我就要siRNA合成效果好的合成方式，嘿嘿，是不是容易成功呢？）。

（图5 DSIR 设计的siRNA序列基本信息简介）

# 其它siRAN设计网址

siDirect version 2.1 （https://sidirect2.rnai.jp/）高效、靶向特异性 siRNA 在线设计网站。实践过程中，发现该网站操作性更前，实验小白可以试一试。

（图6 siDirect设计siRNA界面展示）

# Thermofisher设计siRNA

siRNA利用Thermofisher进行设计，在很多的推文中都有详细的介绍，也是比较好用且操作性比较easy的网站，实验小白可以去试一下。

（图7 Thermofisher进行siRNA设计界面展示）

3 siRNA转染

3.1 细胞准备

一般来说，细胞在传代24h左右，融合率达到30-50%转染效率较好，对于贴壁细胞应该重复打散制备单个细胞后种植（但是也不能机械或酶消化处理过度，要找好平衡点），对于悬浮细胞，转染时候也应该具备一定的数量和细胞状态，以24孔板为例，转染时候细胞数量应该在4-8 ×10⁵/孔（干性强的细胞应该少一倍左右）。

3.2 siRNA准备

从拿到siRNA到整个关于会直接触到siRNA的过程都应该注重保持siRNA的质量，因为RNA酶无处不在（这也是为什么最先发现遗传物质是DNA，而不是RNA的一个因素）。首先拿到siRNA时候，在细胞间或无菌操作台进行离心，然后添加RNase-free H₂O进行siRNA的配制储存液（20μM/L）分装保存，避免反复冻融（建议不超过3-5次，最好一次）。

3.3 siRNA转染

转染前后细胞培养在无抗生素培养基中，转染前12h or 6h更换无血清培养基（血清蛋白带负电会与siRNA竞争结合到阳离子脂质体）。转染的时候根据公司合成的siRNA推荐转染浓度进行（一般来说可以参考质粒转染浓度，siRNA：质粒= 0.8-1.1），不过建议在首次实验，应该在最佳浓度前后在设置各一个对照组。配制转染工作液时候，应充分混匀，然后在室温让siRNA与转染试剂作用15-20min作用，然后均匀滴加到细胞中，画“8”或“十”充分让转染工作液与细胞培养基混匀。

 表1 siRNA转染时各试剂使用量

（备注：V1：无血清培养基，V2：opti-MEM，其中在V1+V2的混合液中还需添加对应体积的转染试剂）

3.4 siRNA效果评估

一般来说，细胞在转染48-72h进行靶基因（也有24h，96h大可不必，细胞都长了几代了，没结果就是没结果，特殊情况除外“哈哈”），敲低/沉默效果检测，最常见的是qRT-PCR和western blot。4 siRNA成功的关键因素

# 1 siRNA序列设计两到四条

应在靶基因的3′端（19核苷酸）进行siRNA潜在靶向序列设计。设计好的潜在siRNA序列在GenBank数据库进行BLAST，去掉其他基因有显著同源性的靶序列（错误靶向）。当然，在设计的siRNA序列应该含有较少的或者没有二级结构。

#2 siRNA序列40–55％ GC含量

研究表明40–55％ GC的含量敲低效率高于GC含量高于55%，因此在网站设计好的siRNA引物时候，也应该根据关注GC的含量。

# 3 siRNA避免/减少与RNA酶接触

无处不在的RNA酶能够破坏其结构siRNA，进而影响siRNA活性，可以说有活物活动的地方均有RNA酶的存在，例如皮肤，头发，唾液等，因此，在拿到合成的siRNA时应该特别注重放RNA酶污染，戴好口罩和手套在细胞间拆开。

# 4 良好的细胞状态

正常情况下，健康细胞对外界的物质的摄取更容易，因此健康细胞的效率高于生长不佳的细胞。一般情况下，在传代细胞生长24h小时候，密度应控制在30-50%，且控制传代时细胞被均匀打散成单个细胞，这样子的转染效果最佳。转染的细胞传代次数不能太多，一帮情况下细胞在传代15-17代已经出现比较明显的衰退，虽然理论上时候50代，但理论和实践差异是很大的。

# 5避免使用抗生素和血清

一般来说，抗生素在细胞内的积累是有毒性的，因此在siRNA转染前后（72h内：24h用于传代细胞生长，48h用于转染后的生长）的实验过程中应该尽量避免使用抗生素，同时血清尽量在转染的时候使用，因为血清中富含各类蛋白，带有大量负电荷，会和阳离子脂质体结合，和核酸相竞争，导致转染效率不高。

# 合适的对照组

对照的分为阴性和阳性对照，对于阴性对照是非特异性siRNA，设计时候也应该注意其序列的特异性；阳性对照，一般会会在管家基因进行设计；此外，也应该设置siRNA转染浓度梯度组，寻找到最佳的siRNA转染浓度。

5 结束。

（爱自己！！！做科研!!! 每文格言“心理学上，有一种“达克效应”：认知水平越低的人，反而越喜欢自以为是。真正靠谱的人，往往低调内敛，从不炫耀”如果有用，关注楼主GBhouse，点赞+讨论，攻击型人格请请请不要关注和阅读！！！）

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参考：

[1] https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home/references/ambion-tech-support/rnai-sirna/general-articles/ten-tips-for-a-successful-sirna-experiment.html

[2] https://zhuanlan.zhihu.com/p/59091766

[3] https://zhuanlan.zhihu.com/p/593895588

[4] Park JH, Hong SW, Yun S, Lee DK, Shin C. Effect of siRNA with an asymmetric RNA/dTdT overhang on RNA interference activity. Nucleic Acid Ther. 2014 Oct;24(5):364-71. doi: 10.1089/nat.2014.0494. PMID: 25211666; PMCID: PMC4162433.

[5] Dana H, Chalbatani GM, Mahmoodzadeh H, Karimloo R, Rezaiean O, Moradzadeh A, Mehmandoost N, Moazzen F, Mazraeh A, Marmari V, Ebrahimi M, Rashno MM, Abadi SJ, Gharagouzlo E. Molecular Mechanisms and Biological Functions of siRNA. Int J Biomed Sci. 2017 Jun;13(2):48-57. PMID: 28824341; PMCID: PMC5542916.

[6] Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 1998;391:806–811.

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[9] Bernstein E, Caudy AA, Hammond SM, Hannon GJ. Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature. 2001;409:363–366.

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[16] https://www.biochempeg.com/article/339.html

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