3 款简单实用 PCR 引物设计软件

No.1 NCBI 的 Primer-Blast

1、打开以下网址： http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ 进入 Primer-Blast 界面，开始引物的设计。

2、验证引物好坏

3、外显子内含子（Exon/intron）

如果设计的引物是跨内含子和外显子的交界处，可在此处设置成为 Primer must span anexon-exon junction。外显子的匹配碱基数和内含子的长度等设置一般选择默认。

4、特异性（Specificity check）

在 specificity check 区，选择设计引物或验证引物时的目标数据库和物种。这一步是比较重要的。其中，数据库中的 RefSeq mRNA 和 Genome (reference assemblies from selectedorganisms)是经过专家注释的数据，可得出更准确的结果。

5、最后建议用 oligo6 或 primer5 验证引物自身的特性：发夹结构、引物自身二聚体、错配和引物间二聚体，△G 的绝对值。

No.2 Primer3 Plus

1、点击这个网址：http://www.primer3plus.com/可打开 Primer3Plus 软件。

点击 Run latest Version of Primer3Plus 进入了设计引物的主页面。

2、在 General Settings 中，依照引物设计原则，设置产物长度（<=400bp，最好 100-150bp）、GC％（最好为 45%－55%）、引物长度（最好为 22-24bp）、TM 值（58-60℃，最好 60℃）。

4、设计好引物后，仍需用 NCBI blast 引物验证，点击 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 可出现以下界面。

5、点击 Basic BLAST 中的 nucleotide blast 选项，在下面框中，按照 5’－3’顺序，分别输入上游引物和下游引物，上下游引物之间间隔 20 个以上 n。

6、选择物种数据库，如 Human，Mouse 或者 Others（如果是非人和非小鼠物种）。

7、选择 Somewhat similar sequences(blastn)

8、点击 Algorithm parameters, 在 Expect threshold 输入 1000，在 Word Size（读长）输入 7，便可按照 7 个一组核苷酸序列放到 GeneBank 中进行比对。

9、点击 BLAST 进行比对得出结果。颜色代表得分，选择引物的原则是：列表中大部分是目的基因，说明引物特异性高；但是可能物种不同，说明该基因在不同物种中保守。

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