构建质粒还没成功吗，快来看我填的坑……

1：提取质粒浓度太低：质粒分为低拷贝和高拷贝质粒，如果质粒浓度太低，但是能确保质粒是正确的情况下依旧可以往后做，一次性可以提取多管，全部用于后面的酶切。

2：PCR连接产物：一般采用无缝克隆进行pcr，引物会根据酶切位点前20个碱基+酶切位点+插入序列引物去设计，会引物的Tm值会非常被动，我的引物，上游50°，下游70°，需要跑一个梯度PCR，确定一个最佳TM，再去跑PCR纯化。酶建议用PCR高保真酶，不然很容易碱基突变。

3：酶切：一定要选择正确的酶（根据snapgene上的确认只有一个酶切位点），温度如果不一样，先低温切在高温切。关于酶切的体系，因为我的酶比较贵，所以没有按照说明书上的体系，我是加定量酶之后，疯狂加质粒（超过推荐体系的量是没关系的），体系直接扩大到400ul（酶只加了4ul），酶切一小时。

4：跑胶酶切：大载体和pcr连接产物都是采用切胶回收，这样纯度高。

5：无缝克隆试剂：我用的是无连接酶的无缝克隆试剂，可以防止载体自连。关于无缝克隆的原理可看试剂盒说明书，也看09年的原文Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases 写的很详细。

6：转化进入感受态：电转和化学转，电转效率高（也可能出现返璞归真，化转效率高），感受态细胞放在冰上融化10min，电转杯（电转杯厚度请看清楚）提前放进冰箱，电转务必擦干净电转杯，电转杯在电压杯里面的放置位置可别弄反了。Ps：如果电转做不出来，请毫不犹豫改用化学转，会有不一样的惊喜~

7：涂布：涂布说来简单，可踩了不少雷，板子上一直出现菌膜，先说结论：长菌膜最可能是板子抗生素失效了（在我看来就只有这一种可能）。我尝试过是不是因为细菌培养的湿度太高，板子没烘干…等等各种都试过一直还是有菌膜，还去了解到氯霉素抗生素分为左旋和右旋，左旋是具有抗菌性质的，但是抗生素试剂也是没问题的，用了其他同学的板子却没有出现这种问题，后来才发现我和其他同学的抗生素用的品牌不一样，我那个抗生素还没过期（阿某丁牌），但是已经失效了。配置培养基加药小tips：灭完菌建议放进烘箱温度为50，等培养基温度恒定在50，可以直接加药，板子倒的也好看哟~

8：转化出来的菌落pcr: 假阳性：无缝克隆载体自连是有可能的，还有假阳性可能是因为在涂布的时候含有你转化加入的片段。

9：测序结果：测序失败：送菌的话，测序公司有可能提质粒就会出现问题，如果自己确定能p出来条带很亮，建议自己提质粒再送去测序。或者换个测序公司（qk公司经常测不出）

重叠峰：有可能出现菌落污染了，要挑单菌落，或者是引物污染了（或者引物具有非特异性），重新合引物测序。

最后就是测序成功啦~~愿每一个构质粒人都能顺顺利利~