默克：PROTAC的ASD：喷雾干燥固体分散体赋能制剂开发

药物研发客

发布于 2024-03-06 · 浏览 2915 · IP 上海上海

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默克：PROTAC的ASD：喷雾干燥固体分散体赋能制剂开发

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摘要：蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）是一类很有前途的药物，具有独特的作用方式。PROTAC能够靶向多种结构，包括转录因子和其他“不可成药”的靶标。PROTACs的溶解性差和溶出缓慢，目前限制了其潜力的广泛利用。迄今为止，只有非常有限的药物递送选择被研究以应对这一挑战。因此，我们探索了无定形固体分散体（ASDs）通过用不同聚合物喷雾干燥PROTAC的模型。从纯度、固态形式、溶出性能和稳定性方面评估所得制剂。与物理混合物相比，过饱和度大幅增加，尽管在两个系统中，PROTAC分子本身已经处于无定形状态。对ASD制剂优越性原因的评估表明，主要因素是活性药物成分（API）在聚合物基质中的药物分子均匀分布，以及与物理混合物相比，含有Soluplus的制剂的润湿性有所改善。当避光和防潮时，制造的制剂在至少8周内保持稳定。

关键字：蛋白水解靶向嵌合体无定形固体分散体蛋白质降解剂使能制剂增溶喷雾干燥分散体

1.引言

蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）是一种很有前途的新方法，在过去几年中引起了学术界和工业界越来越多的关注。第一个PROTAC原型是在2001年开发的（Sakamoto等人，2001）。通过劫持细胞处理系统（即泛素蛋白水解系统），从而降解感兴趣的蛋白质（PoI），这些化合物成为靶向“不可成药”蛋白质的绝佳机会（Békés等人，2022年，Churcher，2018年，Neklesa等人，2017年）。它们的作用方式与常见的占有驱动模型完全不同：通过诱导E3连接酶（将泛素转移到赖氨酸上）和PoI之间的接近，从而导致蛋白质的泛素化，PROTAC充当催化降解引发剂（Burslem和Crews，2017年，Pettersson和Crews，2019年)。除了其独特的作用方式外，对新靶标的适应也相对简单，因为PoI靶向部分可以很容易地交换。PROTACs的这些特性为治疗不同疾病提供了巨大的潜力。为了招募E3连接酶和PoI，PROTAC由两个弹头组成，弹头通过连接器连接。由于这种嵌合结构，所得分子通常具有高分子量和进一步的不利性质，例如水溶性差。这些特性通常导致缓慢的溶出动力学和低口服生物利用度（Edmondson等人，2019年，Pike等人，2020年）。

到目前为止，制剂工作主要集中在溶剂型方法（Burslem等人，2018年，Mares等人，2020年）或纳米颗粒（Cimas等人，2020年，Fu等人，2020年，Saraswat等人，2020年）。尽管几位作者指出了PROTAC作为有前途的治疗剂带给患者的重要性，但仅发表了关于PROTAC药物递送系统的有限研究（Chen等人，2022年，Yang等人，2020年）。

无定形固体分散体（ASD）是一种解决药物溶解度和生物利用度差问题的制剂策略。在ASD的制造过程中，一种难溶性药物被嵌入聚合物基质中。因此，药物从结晶状态转移到无定形状态，理想情况下分子分散在基质中。在无定形形式中，与结晶态相比，分子处于更高的能量、焓和熵态。该基质在储存过程中充当无定形包埋药物的稳定剂，并可能增加化合物的润湿性（Baghel等人，2016）。此外，在溶出过程中，合适的聚合物用作溶解药物的增溶剂和沉淀抑制剂。通过增强药物的溶解度，增加肠道屏障上的梯度，并增强被动扩散（Schittny等人，2020）。到目前为止，大多数ASD制剂都是针对结晶药物分子（例如酮康唑、非诺贝特）开发的。与许多其他药物分子相比，PROTAC通常难以结晶，因此大多数PROTAC分子处于无定形状态。因此，出现了一项不寻常的任务，即开发用于无定形药物分子的ASD制剂。在这里，ASD的适用性可能不同，因为省略了关键步骤之一，即无定形化。药物无定形状态的有益属性，如更高的溶出速率和更高的平衡溶解度，有助于提高溶解度，这些特性已经通过未嵌入聚合物基质中的粗无定形PROTAC得到证明。因此，与相应的物理混合物相比，尚不清楚PROTAC的ASD制剂是否会提供更高的过饱和度。

ASD有许多制造技术，包括基于溶剂的方法，如喷雾干燥、共沉淀、溶剂蒸发，以及基于熔融的技术，如热熔挤出、冷冻研磨和熔融淬火（Vasconcelos等人，2016）。其中，喷雾干燥和热熔挤出是最常见的技术。在早期开发阶段，API材料供应通常有限，为稳定和赋予功能性ASD确定合适的聚合物至关重要。因此，已经开发了几种筛选和预测工具，用于成功制造ASD以及从各种聚合物中选择有前途的候选者（He和Ho，2015）。

聚合物首先可分为离子型或非离子型。它们各自的特性决定了在不同生物相关介质中的溶解度。Soluplus是一种聚乙烯己内酰胺-聚醋酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物，由巴斯夫开发用于热熔挤出。此外，在喷雾干燥中也可用作聚合物载体。无论介质的pH值如何，它都是中性和水溶性的，并且已经在各种ASD制剂中应用，这些制剂提供了难溶性药物的过饱和度（Attia等人，2023;巴斯夫制药，2019年）。尤特奇EPO是一种阳离子甲基丙烯酸酯共聚物，通常用于掩味，由于结构中的叔胺，在低pH值下可溶（赢创运营有限公司，2021）。该聚合物可以喷雾干燥和挤出，其作为ASDs中聚合物载体的价值已在文献中得到证明（Kojima等人，2012）。

最近刚刚发表了第一项关于ASDs作为PROTAC制剂技术的研究，研究人员通过真空压缩成型基于von Hippel-Lindau（VHL）的PROTAC分子来制造ASD，并将这种制剂技术与液化方法进行了比较。将PROTAC配制为ASD证明了增溶，而液质固体制剂技术在体外没有发现益处（Pöstges等人，2023年）。粗PROTAC分子ARCC-4在加工前处于无定形状态。尽管如此，将其配制为ASD显示出很强的益处。因此，问题来了，在生物相关介质中的增溶方面，其他（无定形）PROTAC是否也会从ASD的制剂中受益。如果是这样，其原因和过饱和度的机制仍有待研究。

在本研究中，选择了基于Ceblon PROTAC，它对应于另一大组PROTAC（Bricelj等人，2021年，Ishida和Ciulli，2021年）。所使用的模型化合物具有不利的性质，不符合Lipinski的五法则，如高分子量（MW=914Da）、高亲脂性（chromLogD=7.0）和低生物相关介质溶解度（S_FaSSIF的=20μg/mL）。通常，在双功能降解剂中经常观察到类似的特性，使MS4078成为基于Cereblon（CRBN）的PROTAC类的典型代表（Edmondson等人，2019）。筛选了合适的聚合物来制备该模型PROTAC的二元ASD。从10多种不同的候选聚合物中，选择了两种，并首次制备了使用不同聚合物的基于CRBN的PROTAC的ASD，并评估了通过喷雾干燥制造其可行性。粗模型PROTAC MS4078（Zhang等人，2018）处于无定形状态，到目前为止，据我们所知，尚未描述母体化合物的晶体结构。将制造的制剂与相应的物理混合物进行比较，并特别关注两种无定形系统提供的过饱和度。通过评估粒径、API分布和润湿性来检查系统之间的决定性差异。此外，本研究还解决了制剂在不同储存条件下的稳定性问题。

2.材料与方法

2.1.材料

MS4078购自MedChemExpress（美国）。Soluplus、Kollidon30（K-30）和KollidonVA64（VA64）购自巴斯夫（德国）。尤特奇赢创（德国）的EPO（EPO）和Eudragit L100-55（L100-55），不同等级的醋酸羟丙甲纤维素琥珀酸酯（HPMCAS HF，MF和LF），来自信越（日本）的羟丙甲纤维素（HPMCP50（HP-50））和来自伊士曼（美国）的醋酸纤维素（CAP）。ParteckMXP（MXP）和MXP3–82（3–82）由Merck KGaA（德国）提供。结构如图S1所示。高品位乙腈（ACN）和甲醇（MeOH）、分析级三氟乙酸（TFA）、二氯甲烷（DCM）、二甲基甲酰胺（DMF）和二甲基亚砜（DMSO）由默克公司（德国）生产。

用于制备空腹态模拟肠液V1（FaSSIF）的FaSSGF/FaSSIF/FeSSIF粉末购自Biolevent（英国）。氢氧化钠、氯化钠、磷酸二氢钠、1N盐酸和1N氢氧化钠溶液由Merck KGaA（德国）提供。所有水溶液均用纯化水（MilliQ（Merck KGaA，德国））制备。

2.2.化合物的热力学溶解度

通过将过量的化合物称量到小瓶中并加入预热的FaSSIF来测定热力学溶解度。将混悬液液在37°C和300rpm下搅拌24小时。从混悬液中取出样品，离心，并用乙腈以1：1的比例稀释上清液。通过超高效液相色谱（UPLC）进行定量（见2.7）。

2.3.96孔板中溶剂可行性筛选

根据Auch等人（2018）对合适的聚合物进行了小型化溶剂筛选。简而言之，将10mg/mL的不同聚合物溶解在90：10（V/V）DCM/MeOH或DMF中。将API以3.33mg/mL溶解在相应的溶剂中。在96孔板中制备含有90%（w/w）聚合物和10%（w/w）API的API-聚合物溶液。DCM/MeOH使用干燥器和真空泵（Vacuubrand，德国）蒸发，而DMF使用冷冻干燥机（Alpha2–4LSCplus，CHRIST，德国）蒸发。在标准光和偏振光下（IX73，奥林巴斯，日本和VHX-7000，基恩士公司，日本）下评估所得的API聚合物薄膜。对于溶出度测试，向每个孔中加入200μL FaSSIF和两个玻璃球。在37°C和700rpm振荡1小时和2小时后（ThermoStar，BMG Labtech，德国），取出100μL并通过0.45μm滤板（AcroPrep^TM系列Advance，颇尔公司，美国）。滤液用相应的有机溶剂稀释，用UPLC分析（见2.7）。此外，在40°C和干燥条件下制备稳定性样品，并通过在硅胶干燥器中或在75%RH下储存。贮藏7d后进行目视宏观和微观评估以及溶出度测试。

2.4.制剂的制造

喷雾干燥制剂使用配备1mm喷嘴的4M8-TriX（ProCepT，比利时）制造。使用固体浓度为2%（w/w）（10%（w/w）API和90%（w/w）聚合物）的溶液，溶于90：10（V/V）DCM/MeOH溶液。喷雾干燥参数汇总于表1中。

表1.含MS4078的制剂的喷雾干燥参数。

聚合体

API

Tin [℃]

Tout[℃]

风速_室[m³/min]

风速_气旋[m³/min]

气流_喷嘴[L/min]

EPO

MS4078

36–38

0.3

0.1

Soluplus

MS4078

40–42

0.3

0.1

2.5.物理混合物的制造

通过将不同成分与研钵和研杵充分混合来制备物理混合物。

2.6.制剂的稳定性试验

将生产的制剂用干燥剂储存在2-8°C、25°C和40°C下，并在40°C/75%RH下储存8周。在开始以及4周和8周后，通过UPLC分析样品的含量和纯度。此外，使用VHX-7000，通过差示扫描量热法（DSC，见2.6.1.）、X射线衍射法（XRD，见2.6.2.）以及标准显微镜和偏振显微镜分析固态。此外，还进行了小规模的非漏槽条件溶出试验（见2.6.3）。

2.6.1.DSC和mDSC分析

DSC和调制DSC（mDSC）分析使用DSC250（TAInstruments，美国）进行，该分析使用铟校准焓，并使用锡、铟、4-硝基甲苯、环己烷和正辛烷作为参考校准温度。校准每三个月进行一次。对于传统的DSC分析，将6-10mg样品填充到铝锅中，并用盖子封闭。对未穿孔的坩埚进行两个加热和冷却循环：以10°C/min的加热速率加热至190°C，以20°C/min的冷却速率冷却至-25°C。

mDSC分析是在穿孔的盖子上进行的。测量参数取决于所使用的聚合物，如表2所示。

表2.mDSC测量参数。

聚合体

振幅[°C]

周期[s]

底层加热速率[°C/min]

EPO

0.4

0.5

Soluplus

0.4

1.0

使用TRIOS软件（TAInstruments，版本：5.4.0.300）测定玻璃化转变。在热流信号（或可逆热流）的阶跃之前和之后，拟合切线，并将玻璃化转变温度确定为半高中点。

2.6.2.XRD分析

对于XRD测量，样品在没有凹槽的硅背景样品架上制备。在D2移相器（Bruker，USA）上以6至35°2θ的Bragg-Bretano几何形状，在大约3小时的测量时间内对其进行了分析，步宽为0.02°。样品以5rpm的速度旋转，使用Cu-Kα辐射（波长：1.54060Å），并通过Ni过滤器实现与Kβ的分离。测量在30kV和10.0mA下进行，1D-LynxEye作为检测器。

2.6.3.非漏槽条件溶出度测定

非漏槽条件溶出度测定基于Auch等人（2018）和Gottschalk等人（2023）。称取约4.8mg样品到Eppendorf管中，加入1.2mLFaSSIF（在37°C下预热）（cMS4078型=400μg/mL）。将混悬液以1000rpm涡旋60秒（Vortex-Genie2，ScientificIndustries，USA），并在37°C（Thermomixercomfort，Eppendorf，Germany）下保持2小时，不搅拌或摇动。在每个采样点（5、10、15、20、30、45、60、90和120分钟）前2分钟将样品从热混合器中取出并以15000rpm离心1分钟（Mikro200R，海蒂诗，德国）。取出50μL上清液并用乙腈稀释用于UPLC分析（见2.7）。将剩余的混悬液在1000rpm下通过短涡旋期（20秒）重新分散，并置于Thermomixer中。所有样品一式三份制备。

2.7.UPLC分析

使用WatersAcquityH-Class系列UPLC系统（沃特世公司，德国）分析UPLC样品。为了分析MS4078，使用了WatersAcquityBEHC8色谱柱（2.1x50mm，1.7μm）。流动相包括乙腈（溶剂A）和含0.1%（V/V）三氟乙酸（溶剂B）的水。有关梯度、流速和进样体积的详细信息见表S1。使用波长为271nm进行检测。

2.8.拉曼成像

将喷雾干燥的固体分散体（SDD）压制成片剂（直径：10mm），压缩力为105N使用半自动压力机PE-010（Mauthe Maschinenbau，德国）。在配备蔡司显微镜物镜（德国蔡司）的Apyron共聚焦拉曼显微镜（WITec，德国）上进行拉曼成像。使用功率为70mW的785nm激光器和0.3s（Soluplus）或0.4s（EPO）积分时间，以∼100倍放大倍率评估样品。在10x20μm的矩形上进行映射，采集60x90（Soluplus）或30x80点（EPO）。光谱的平滑是通过Savitzky和Golay的方法使用每侧的10个邻居和一个二阶多项式完成的（Savitzky和Golay，1964）。

2.9.电子显微镜和能量色散X射线光谱（EDS）

扫描电子显微镜（SEM）使用了配备钨阴极的VEGA3XMU（德国TESCAN）。测量是在∼800倍放大倍率和15kV加速电压下进行的。能量色散X射线光谱（EDS）在带有硅漂移探测器的BrukerQuantax800上进行（XFlash6/60，Bruker，Germany）。在由喷雾干燥制剂（见2.8.）制备的片剂上进行元素映射，时间为23分钟（Soluplus）或56分钟（EPO）。用800x600个采集点测量了333x250μm的面积。

2.10.润湿性测试的片剂生产

开发了纯原料药片剂、纯聚合物片剂、SDD制剂和载药量为75%、50%、25%和10%（w/w）的物理混合物的生产参数。片剂在质构分析仪（TA.Xtplus，Winopal，德国）和GamlenD500（Gamlen Tableting Ltd，英国）。质构分析仪的最大压缩负荷（50kg）不足以从纯API中生产片剂（直径4mm）。使用配备500kg称重传感器的GamlenD500可以施加更高的压缩载荷。对参数进行了优化，以获得足够坚固的片剂，以便进行手动操作。需要降低压缩负荷和速度，以防止过度摩擦和发热。制备片剂进行润湿性测试。观察到不同的接触角和液滴在片剂表面的扩散。必须调整片剂的直径，以避免在润湿性测试期间出现边缘效应。最后，将35mg的相应粉末填充到6mm模具中，并以200kg的负载进行压缩。在进一步使用之前，在显微镜下检查每片药片是否有缺陷。

2.11.润湿性测试

将片剂（见2.10）在室温（∼20°C）和60%RH下调节至少2小时，这是在具有饱和NaBr溶液的腔室中实现的（Greenspan，1977）。在测量中，将5μLMilliQ水自动移液到片剂上，并通过DSA25S（德国Krüss）在3分钟内进行分析。使用内部软件（Advance，版本：1.15.0）的Young-Laplace拟合程序进行分析。

3.结果

3.1.热力学溶解度

有关纯化合物的信息，在37°C的FaSSIF中测定MS40782 24小时后的热力学溶解度，发现为20.21±0.05μg/mL。

3.2.基于溶剂可行性筛选

为了确定适合MS4078的聚合物载体，进行了小规模筛选。MS4078的基于溶剂可行性筛选结果（包括稳定性样品）如图1所示。MS4078的API参比样品的溶解度为∼10μg/mL，证实了纯无定形API的溶解度较差。与API的热力学溶解度相比，在测定过程中溶解的浓度略有降低，这可能是由于化合物的溶出速度缓慢。大多数聚合物无法提供益处，但Soluplus、EPO、MXP和3–82的过饱和度高达纯API的溶解度的50倍。在第二个采样点（2小时后）发现的浓度与第一个采样点的结果相似，或者增加（Soluplus），因此，过饱和度在测定期间稳定。有前途的薄膜也准备用于稳定性测试：它们在40°C下储存7天，并在干燥（使用干燥剂）或潮湿条件（75%RH）下储存。7天后通过偏振显微镜（PolMic）对固态进行重新分析，并在FaSSIF中测试溶出性能。显微评估显示没有变化——既没有观察到相分离也没有观察到结晶（图S2）。无论储存条件如何，储存一周后的溶出度试验结果（图1）与起始值非常相似。

图1.在40°C、干燥条件（t1 40/0）和40°C/75%RH（t1 40/75）下储存7天后，MS4078在FaSSIF中的溶剂型可行性筛选的溶出结果。（平均值±SD（n=3））。

3.3.喷雾干燥制剂

对于喷雾干燥，选择Soluplus和EPO作为载体系统，并成功制备了含有10%（w/w）的MS4078和90%（w/w）的Soluplus或EPO的二元制剂。通过液相色谱检查含量和纯度，分别符合95–105%和>98%的要求。Soluplus的收率>65%，EPO的收率>80%。由于聚合物在挥发性溶剂中的溶解度差，MXP和3–82的制剂尚未喷涂。然而，它们也可能是有前途的聚合物。

3.4.制剂和物理混合物的分析

分析了制剂和物理混合物，重点分析了它们的溶出性能。由于制剂和物理混合物包含相同的组合物，因此该测定的目的是阐明处理步骤对过饱和度及其动力学的影响。此外，还确定了固态和粒径，因为两者都取决于加工步骤，也会影响溶出过程。图2显示了喷雾干燥制剂（SDD）与物理混合物（PM）和粗API相比，在FaSSIF中进行非漏槽条件溶出度测定的结果。纯API迅速溶解，5min后最大溶解量为9μg/ml。之后，浓度迅速下降，表明API从溶液中沉淀出来。相比之下，物理混合物在第一个采样点没有显示出最大值，而是在测定过程中浓度缓慢增加（图2C，图S3）。PM在5min时的浓度低于粗制API，但是，由于粗制API的误差线较大（很可能是由快速溶出动力学和随后的快速沉淀引起的），因此这并不显着。在大多数情况下，对于ASD，过饱和度达到最大值的速度比这里观察到的要快，在两个小时内，过饱和度会增加。这可能是由于聚合物的溶解是限速步骤引起的。SDD制剂证实了MS4078筛选实验的一般结果：与粗API相比，两种聚合物的过饱和度>70倍，2小时后值>280μg/mL。物理混合物仅略有改善，浓度分别高出3倍（Soluplus）和10倍（EPO）。

图2.与粗API（MS4078）相比，在40°C/75%RH下储存4周和8周后，SDDs在FaSSIF中溶出，以及它们相应的A）E，PO和B）Soluplus的PM。400μg/ml处的虚线代表100%溶出。C）MS4078、PM-E和SDD-E溶出结果前60分钟的放大倍数。D）SDD-S溶出结果前30分钟的放大。（平均值±SD（n=3））。

粗API和所有制剂的无定形状态均通过DSC、XRD和PolMic确认。XRD数据如图3所示。API和聚合物以及制造和储存后的制剂在扫描范围内（2θ=6-35°）未显示晶体信号。XRD分析中没有反射表明样品处于无定形状态。该结果与DSC分析一致：在这里，对于纯API，无法确定熔点，但可以通过弛豫在100°C左右的玻璃化转变确认API的无定形状态（图S4）。然而，制剂和PM的DSC和mDSC测量并不能确定所制造制剂的均匀性：DSC数据显示，在与纯聚合物相同的温度下，玻璃化转变。然而，在>100°C的温度下，观察到的热事件不能归因于玻璃化转变、熔点或其他确定的热事件。因此，进行了调制DSC分析，以更好地分离热事件并确定是否存在多个玻璃化转变。发现了纯EPO的几个步骤，这些步骤也存在于物理混合物的测量中（PM-E10%）。粗制原料药还表现出不同的步骤，其中大多数步骤与EPO的步骤处于相同的温度范围内（图S5）。这种巧合阻止了单相和多相系统之间的区别。在整洁的Soluplus的情况下，单个Tg在∼110°C下被发现。然而，对物理混合物的分析并没有揭示不同的步骤，而只揭示了一个宽泛的Tg(图S5）。因此，无法从DSC和mDSC测量中得出关于均匀性的结论。

图3.EPO、MS4078、Soluplus和SDD-E和SDD-S在40°C/75%RH下储存8周后开始（t0）和8周后的X射线衍射图。

SDD制剂的粒径是通过显微镜确定的，其中单个颗粒的最大延伸作为粒径。直径在1-20μm（SDD-E）和2-35μm（SDD-S）之间，而物理混合物的直径为2-30μm（PM-E10%）和10-100μm（PM-S10%）。球形SDD颗粒略带黄色，颜色均匀。在PM中，聚合物和API颗粒可以通过显微图像中的颜色清楚地区分：MS4078的黄色颗粒和EPO或Soluplus的白色颗粒（图S6）。

在干燥条件下（2–8°C、25°C和40°C）以及潮湿、加速条件（40°C/75%RH）下，对两种SDD制剂的储存稳定性进行了检测。对于这两种聚合物，在潮湿条件下观察到MS4078的纯度下降，并伴有颗粒的团聚或熔融（表3，图S6）。团聚可以通过聚合物的吸湿性来解释：由于水的掺入，分子的流动性增加，因为水具有增塑作用。这种效应与升高的储存温度相结合，促进了颗粒的融合。在相同温度（40°C）的干燥条件下，SDD-E的纯度也有所下降，但与潮湿条件相比，纯度下降幅度要小得多。对于所有其他样品，纯度保持在较高水平，并且与起始值相似（表3）。即使在加速条件（40°C/75%RH）下储存后，固态分析也没有发现变化。相反，8周后仅发现无定形晕（图3），并且在偏振光下没有双折射（图S6）。在SDD-E的情况下，溶出性能不受存储的影响;然而，SDD-S在40°C/75%RH下储存后，在溶出度测定的最初几分钟内表现出明显的滞后时间。然而，120分钟后溶出了超过250μg/mL的MS4078，与开始分析的结果相匹配（图2）。

表3.SDD-E和SDD-S在不同条件下储存8周后开始（t0）的纯度。

条件

SDD-E纯度[%]

SDD-S纯度[%]

98.6

98.9

8w 2–8°C

98.4

98.8

8w 25℃

98.1

98.8

8w 40℃

97.3

98.8

8w 40°C/75%相对湿度

82.9

97.1

3.5.EDS元素映射和拉曼成像

SDD和物理混合物之间一个相当明显的区别是API或多或少均匀地分散在SDD的聚合物基质中，而它们位于PM中的单独颗粒中。由于这可能是SDD过饱和度提高的一个原因，因此进行了拉曼和EDS元素映射。通过这些分析技术，可以评估PROTAC在其聚合物载体中的分布，因为它们允许API和聚合物之间的空间分辨率至少低至微米级的团簇。

通过EDS元素映射，概述了由SDD-E和SDD-S制备的片剂上的API分布。分析了333x250μm区域内的每个点（像素大小：416nm）。特征元素是氯化物和硫，它们存在于MS4078中，但不存在于聚合物的结构中（图S1）。两种元素都以较高的X射线强度散射，与原子序数较低（C、N、O）的元素相比，X射线强度的散射效果很好。图4显示了SEM图片、两种测量的光谱以及Cl和S的分布。从Cl和S原子的分布来看，没有发现大团簇，表明API在聚合物基质中的单相体系和均匀分布。没有分析由PM制备的片剂，因为聚合物和API的簇已经在20倍放大倍率拍摄的显微图像中区分。补充信息中给出了由SDD粉末和物理混合物制备的片剂的图片（图S7）。

图4.SDD-E（美）和SDD-S（美）的SEM照片。SDD-E（D）、SDD-S（E）的EDS谱图以及SDD-E（B，C）和SDD-S（G，H）中Cl和S的分布。

在绘制10x20μm的区域并评估获得的拉曼光谱后，对MS4078的分布进行了更详细的分析。获得了原料药和聚合物分布的热图。在图5中，显示了这些热图，以及检测到最少API的点的光谱以及识别出最大聚合物的光谱。

图5.SDD-E（A：聚合物，B：API）和SDD-S（E：聚合物，F：API）的聚合物和API分布热图。比例尺（右上角）为6μm。API的最小信号或聚合物的最大信号位置的拉曼光谱（C：SDD-E（原始）和G：SDD-S（平滑））。最小和最大光谱的位置在热图上用白色和深色十字表示。SDD-E和SDD-S在整个区域的平均拉曼光谱与聚合物和API（D，H）的拉曼光谱相比。

在EPO的情况下，最强烈的峰值在1446cm⁻¹是聚合物的特征，而峰值位于1614cm⁻¹处仅存在于API的光谱中（图5D，标记区域）。在检测到最少API的区域，API仍然可以看到清晰的信号（图5C）。这同样适用于EPO的最大谱图，其中还发现了API的代表峰。这两项观察结果都表明，检测到内容存在细微变化。此外，由于在热图中没有可见的簇，因此根据拉曼显微镜的分辨率（∼0.25μm），可以得出结论，API是均匀分布的。

Soluplus和MS4078的光谱在很大程度上重叠。Soluplus最强烈的山峰在1446cm⁻¹处第二高峰为699cm⁻¹是可以识别聚合物存在的两个点。然而，对于API来说，在1757cm⁻¹处只有一个峰值标识API。另一方面，峰值在1733cm⁻¹处在Soluplus光谱中也发现了，导致组合光谱中的双峰（图5H和图S8）。API和Soluplus分布的两张热图显示了相似的图景，最小API信号的区域也是Soluplus的最小信号（图5E，F）。这是一个重要的观察结果，因为相反的图片将指示不同的阶段。这种高信号和低信号聚类的原因很可能是基于样品的表面形貌。从热图中，可以估计颗粒形状（高信号），而“粒子”之间的区域是低信号区域。因此，最小信号的点可能失焦了。因此，API的最小信号和Soluplus的最大信号的频谱非常嘈杂，这完全是由表面粗糙度引起的。因此，在1740cm⁻¹左右区分单峰或双峰是不可能的（图S8）。另一种方法是使用API最强烈的峰值（1599cm⁻¹/1615cm⁻¹处的双峰).然而，它们与一个相当小的Soluplus峰重叠（最大值：1630cm⁻¹).在最小和最大光谱中也可以看到一个强烈的峰值。为了更好地评估，最强聚合物峰的比值（∼1445cm⁻¹）和最强烈的API峰值在∼1599cm⁻¹根据平滑数据计算得出（图5G和表4，相应原始光谱的图表可在补充信息（图S8）中找到）。根据强度比，可以得出结论，信号来自API。总而言之，这证明了-就像EPO一样-API和Soluplus不会在较低的微米范围内形成集群。

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片剂的拉曼图谱证实了EDS测量的结果：两种分析技术都表明，在SDD-E和SDD-S的聚合物基质中，MS4078在相应的分辨率（∼1μm）内是单相系统和均匀分布的。

、、度。

在DSC分析中，可以检测小至∼30nm的磁域中的不同相，使其成为一种非常灵敏的分析技术。然而，这仅适用于高ΔCp（热容），足够高的ΔTg在两种成分的玻璃化转变之间，并且至少∼20%的样品要相分离（Padilla等人，2011）。不幸的是，DSC和mDSC结果在本研究中尚无定论，也不清楚API是否均匀分布在基质中。除了DSC和mDSC分析中热事件的相似位置外，原因之一可能是10%的药物载量。在低载药量下，检测多相的灵敏度可能是一个问题。正如在其他地方调查和讨论的那样（Qian等人，2010），仅依靠DSC分析并不总是足以检测相分离，并且方法的组合更适合澄清这个问题。因此，选择拉曼光谱和EDS作为评估相分离的补充方法。通过能量色散光谱，从片剂表面概述了API的分布：在这里，绘制了一个区域，并考虑了S和Cl的分布，以给出API的粗略分布。根据该方法，两种元素都是随机分布的，在∼800倍（即像素尺寸为416nm）的放大倍率下，没有发现有或没有这两种元素的团簇（图4）。因此，可以假设MS4078在SDD-E和SDD-S中分布均匀。放大后，在较小的切口上进行拉曼成像，以更高分辨率（∼0.25μm）评估聚合物和API的分布。通过热图和对MS4078最小值或聚合物最大值的区域的评估，两种制剂中都确认了API的均匀分布（图5）。由于两种分析技术的分辨率不同，对于尺寸为1μm<团簇，无法得出结论。相比之下，API和聚合物的粒径分别为5-30μm（API，PM-E）、7-20μm（EPO、PM-E）、10-50μm（API、PM-S）和10-100μm（Soluplus，PM-S）（图S6）。因此，API在SDD制剂中以更精细的规模分布，如EDS和Raman所示。如上一段所述，ASD制剂的均匀性是过饱和度稳定的一个重要因素。此外，溶出过程中聚合物和API的释放也受到聚合物基质中分布的影响（Baghel等人，2018，Schittny等人，2020）。这两个因素的相互作用最终使稳定的过饱和度增加。因此，MS4078在聚合物基质中的均匀分布很可能是SDD制剂优于无定形PM的决定性因素之一。

ASDs的不稳定性是一个巨大的缺点，可能对这种制剂方法有害。相分离以及化合物的重结晶是挑战，可以通过选择合适的聚合物载体来解决（He和Ho，2015）。为了评估不稳定性，需要在不同储存条件下进行稳定性测试。在PROTAC或其他难以结晶的无定形化合物的特殊情况下，可能不会发生再结晶，但其他不稳定性，如化合物的化学降解或相分离，从而影响溶出行为。如前几段所述，API的均匀分布可能是影响溶出性能的决定性参数。因此，将生产的SDD制剂额外储存超过八周。样品保持在2-8°C、25°C和40°C，不受潮影响，此外，一个样品储存在40°C和75%RH下，以评估加速条件和湿度应力。在几个时间点，通过XRD和偏振显微镜检查纯度和固态，并评估溶出性能。在潮湿条件下储存导致细颗粒团聚（SDD-E）或融合（SDD-S）（图S6），并且化合物的纯度受到负面影响（表3）。然而，整体过饱和度并未受损，即使使用大颗粒SDD-S，其浓度也稳定在与新制造的制剂相似，尽管与原始细颗粒相比，由于表面积减小，溶出动力学较慢（图2）。对高应力样品固态的评估表明，XRD和PolMic没有差异（图3和图S6）。在干燥条件下储存的样品未显示固态或溶出性能的任何变化（数据未显示），纯度保持高，与起始值相似（表3）。在溶出度测定期间观察到的情况并不表明储存期间存在相分离，因为过饱和度仍然很高。总体而言，在干燥条件下，制剂在测试时间内是稳定的。相反，在潮湿条件下，观察到化合物的降解，但没有影响过饱和度的物理不稳定性。因此，必须将制剂存放在防潮的地方。

5.结论

无定形固体分散体广泛用于提高BCSII类和IV类化合物的溶解度。由于PROTAC经常表现出溶解度问题，这可能是将口服PROTAC制剂推向市场的关键一步。本研究检查了通过用不同聚合物喷雾干燥制造PROTAC模型的ASD。应用了小规模筛选方法，并帮助选择聚合物进行放大实验。验证了筛选结果的转化，并测试了生产的制剂在不同储存条件下的稳定性。含有10%基于CRBN的PROTAC的ASD在避光和防潮的情况下，在高达40°C的8周内保持稳定。此外，与无定形纯API相比，这些制剂能够提供非常高的过饱和度，有趣的是，与它们的PM相比也是如此。

研究了ASD与具有相应聚合物的纯无定形API的PM相比具有优越性的原因。结果表明，API在聚合物基质中的均匀分布可能需要表现出高过饱和度。此外，对于Soluplus，与物理混合物相比，SDD制剂的润湿性得到改善可能会改善效果。然而，粒径并不是影响过饱和度的关键因素之一。

这项工作补充了Pöstges等人（2023）的结果，因为ASD是一种有用的制剂类型，可以增强PROTAC的溶解度。在本研究中，可以成功应用一种更常见的方法，即喷雾干燥。此外，该概念可以从VHL扩展到基于CRBN的PROTAC，证明ASDs在PROTAC增溶方面具有广泛的适用性。

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最后编辑于 2024-03-07 · 浏览 2915

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默克：PROTAC的ASD：喷雾干燥固体分散体赋能制剂开发

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