油酸酯（油酸钠）建立HepG2、LO2脂肪肝细胞模型（NAFLD）

—岳南希/河北医科大学硕士学位论文

1. 前言

非酒精性脂肪性肝病(non-aLcohoLic fatty Liver disease, NAFLD)指的是除酒精及其他明确的损伤肝脏因素所致的，以肝细胞内过度脂肪沉积为主要特征的一种临床病理综合征。其病理变化随着病情进展，表现为单纯性脂肪肝，脂肪性肝炎，及其相关的肝硬化和肝细胞癌。流行病学显示，NAFLD患病率逐年上升，并呈低龄化趋势演变，且是引起隐源性肝硬化和导致肝移植的主要原因。

NAFLD的发病机制具有多样性和复杂性特点，胰岛素抵抗，脂代谢紊乱，氧化应激，炎症等因素都可能导致NAFLD的发生发展。除此之外，遗传、环境也会对其产生影响，然而人们对NAFLD发病机制的研究仍略知一二。目前针对NAFLD的治疗方法也较为局限，主要在控制饮食，增加运动等对患者生活方式方面进行干预指导，专属治疗NAFLD的一线药物仍未被发现。因此对NAFLD 发病机制的研究，寻找其治疗的特效药物，具有重要的科学和应用价值。

二甲双胍是治疗2型糖尿病的首选一线药物，已在临床使用近60年。研究报道，大约70% 的2型糖尿病患者伴有NAFLD，而且多数 NAFLD 患者也伴有胰岛素抵抗，因此二甲双胍可能是治疗NAFLD 的潜在特效药。KrüppeL样因子4（KrüppeL-Likefactor4，KLF4）是一种含锌指结构的多能转录因子，参与调控多种细胞生物学过程，有研究提示KLF4在胰岛素抵抗中起到重要作用。研究表明，二甲双胍可通过上调 KLF4 的表达进而延缓肝硬化的发生发展。基于此，作者推测二甲双胍可通过增加 KLF4 的表达从而改善肝细胞脂肪变性。

本研究旨在以KLF4为切入点，探讨二甲双胍的降脂作用机制，对NAFLD发病机制进行深入的研究，选择有效的药物进行针对性治疗，为临床上制订出有效的治疗方案提供理论基础。

为完成上述研究，成功建立“脂肪肝细胞模型”是核心步骤，本文采用0.5 mM油酸钠处理肝细胞24h建立脂肪肝细胞模型。并用1mM二甲双胍处理模型24h，运用油红O染色及TG含量测定来证明细胞水平上二甲双胍降脂作用。

2.材料

油酸钠（油酸酯）及高脂溶剂对照，均购自西安鲲创科技发展有限公司。利用商品化的细胞用高脂细胞添加剂，母液含有高浓度的游离脂肪酸，由于试剂本身为液态、无菌，能与完全培养基直接互溶用于实验，减少了旧方案使用乙醇、NaOH等助溶剂（助溶剂本身有细胞毒性，混杂了高脂试剂的作用）和溶解时的加热操作，节省了操作，增强了实验的稳定性。

3.方法

3.1细胞的复苏

采用快速复苏法复苏细胞。将装有HepG2、LO2细胞的冻存管取出后立即置于37℃水浴箱摇动至完全融化，室温离心1500 rpm离心5min,超净台使用之前照射半个小时紫外消毒杀菌，在超净台中弃去上清，加入含10%胎牛血清MEM培养基，重悬细胞，混匀后接种置培养瓶中，放置37℃，5% CO2,饱和湿度的细胞培养箱中。

3.2细胞的传代培养

采用胰蛋白酶-EDTA消化法，当培养瓶内细胞密度达80%时，从培养箱拿出，弃去培养基，用高压灭菌的1x PBS洗涤2次，加入2mL胰酶消化液，置于37℃消化3min，当镜下观察细胞逐渐回缩，胞体润滑时，表明消化完毕，弃去胰酶，加入2mL培养基，轻轻吹打，调整好细胞密度后，加入新的培养瓶中，补加适量培养基。继续置于37℃，5% CO2，饱和湿度的细胞培养箱培养。

3.3刺激物的配置

将二甲双胍粉末精确称量20 mg，溶于高压灭菌过的三蒸水12.08 mL中，震荡混匀，配置成浓度为1 mM的二甲双胍溶液，避光保存现用现配。将浓度为12 mM的油酸钠溶液，配置成浓度为0.5 mM的油酸钠溶液。介导KLF4过表达的腺病毒载体（Ad-GFP-KLF4）病毒滴度为1x10¹⁰ PFU/mL，最终使用剂量为30 MOI。

3.4刺激细胞

将细胞铺到孔板或细胞培养皿中，待细胞密度到80%左右时，给予细胞不同刺激，在培养基中加入二甲双胍、油酸钠，使培养基中二甲双胍的终浓度为1mM、油酸钠终浓度为0.5 mM，继续培养24h后，收集细胞用于下一步实验。

3.5细胞转染

使用Lipofectamine 2000对细胞进行转染，具体步骤参照Lipofectamine®2000Reagent说明书。将细胞接种到6孔板或细胞培养瓶中，在37℃、5% CO2环境湿润的细胞培养箱内培养24h，待细胞贴壁生长至60%~80%时进行转染。

之后，进行细胞总蛋白的提取及免疫印迹实验。

4.结果与分析

4.1 二甲双胍可显著改善肝细胞脂肪变性

作者在体外、体内水平分别检测二甲双胍是否可以改善肝细胞脂肪变性。首先，体外实验，采用0.5 mM油酸钠处理LO2细胞24h，建立脂肪肝细胞模型。LO2细胞油红O染色（Fig.1A）和TG含量（Fig.1B）检测结果表明，与对照组相比，二甲双胍可明显改善油酸钠诱导的肝细胞脂肪变性。然后，在体实验，采用HFD喂养C57BL/6N小鼠16周，建立小鼠脂肪肝模型。给予HFD小鼠二甲双胍（300mg/kg·day）灌胃处理4周后，对肝脏进行大体形态学观察与油红O染色（Fig.1C），并检测小鼠的体重（Fig.1D）、肝指数（Fig.1E）以及肝脏TG含量（Fig.1F），结果表明二甲双胍可显著减轻HFD诱导的小鼠肝细胞脂肪变性。体内、体外实验结果均表明，二甲双胍可明显改善肝细胞脂肪变性。Con，ControL；OA：OLeicacid；NCD，normaLchowdiet；HFD，highfatdiet；ns，nosignificance。*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001。

4.2在体内、体外脂肪肝模型中，KLF4的表达均明显降低；二甲双胍可上调KLF4的表达

作者采用WesternbLot检测了KLF4在脂肪肝中的表达水平，以及二甲双胍对KLF4表达的影响。结果显示，与对照组相比，HFD组小鼠肝脏中KLF4的表达明显降低；而二甲双胍喂养4周后，KLF4的表达则明显增加（Fig.2A）。在油酸诱导的脂肪肝细胞模型中，KLF4的表达明显降低，二甲双胍处理则提高了KLF4的表达（Fig.2B）。以上结果表明KLF4在体内、体外脂肪肝模型中表达降低，二甲双胍可上调KLF4的表达。

4.3 KLF4过表达可改善肝细胞脂肪变性，敲低KLF4的表达则衰减二甲双胍的降脂作用

为了明确KLF4 的表达对脂肪肝的影响，作者采用介导KLF4 过表达的腺病毒载体（Ad-GFP-KLF4）和敲低KLF4 表达的siRNA 分别过表达和敲低KLF4 的表达。油红O 染色和TG 含量检测可以发现，KLF4 过表达可显著改善肝细胞脂肪变性（Fig.3A，3B）；敲低KLF4 的表达可衰减二甲双胍的降脂作用(Fig.3C，3D)。在体内实验中，通过尾静脉注射抑制 KLF4 表达的腺相关病毒（AAV-shKLF4）以敲低小鼠肝脏KLF4 的表达。对小鼠肝脏进行大体形态学比较和油红O染色（Fig.3E），检测小鼠体重变化（Fig.3F）、肝指数（Fig.3G）和肝脏TG含量（Fig.3H），发现在体内水平敲低KLF4 的表达也可衰减二甲双胍的降脂作用。NC，negative controL; siKLF4, KLF4 siRNA; ns, no significance.*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.

5讨论

非酒精性脂肪性肝病（nonaLcohoLic fatty Liver disease，NAFLD）是多种原因引起的、以肝细胞内脂质沉积过多为特征的一类临床病理综合征。NAFLD不仅会引起肝脏相关疾病（如肝硬化，肝细胞癌），还与2型糖尿病、高血脂、肥胖症等疾病密切相关。随着生活方式和饮食结构的改变，NAFLD患病率逐年上升，且不局限于中老年人群，有逐步向低龄化发展的趋势，已成为慢性肝病主要原因之一。然而NAFLD的发病机制目前仍不清楚，临床多用保守方式进行治疗干预，并无专一特效药物。因此研究NAFLD的作用机制，寻找其治疗的特效药物，具有重要的科学和应用价值。

二甲双胍是具有胰岛素增敏作用的双胍类降糖药物，是治疗二型糖尿病的一线特效药。NAFLD与二型糖尿病之间关系密切，已有众多研究报道，二甲双胍可以通过减少肝细胞内脂肪蓄积进而改善NAFLD。然而二甲双胍对NAFLD的作用机制仍未阐明。本研究中作者采用HFD喂养C57BL/6N小鼠构建小鼠脂肪肝模型，给予HFD小鼠二甲双胍灌胃处理，对其肝脏形态学及脂质沉积情况进行观察与检测，在体内水平评估二甲双胍对肝细胞脂肪变性的影响。结果显示，与对照组相比，二甲双胍治疗组小鼠体重、肝指数、以及肝脏内甘油三酯含量均显著降低，二甲双胍可通过上调KLF4显著减轻HFD诱导的小鼠肝细胞脂肪变性。在体外细胞实验中，二甲双胍也可通过上调KLF4明显改善油酸钠诱导的肝细胞脂肪变性。

小编有话说：

本文采用0.5 mM油酸钠（KC005，西安鲲创科技）处理LO2细胞24h，成功建立脂肪肝细胞模型，结合在体实验，共同揭示了KLF4在二甲双胍改善肝细胞脂肪变性中发挥作用的新机制，为研制治疗 NAFLD 的药物奠定了理论基础。进一步的研究工作，推荐油酸钠、棕榈酸钠（KC006）联合建立HepG2、LO2脂肪肝细胞模型。

参考文献

岳南希. KLF4 在二甲双胍改善肝脏脂肪变性中的作用及其机制研究[D]. 河北医科大学硕士学位论文, 2021, 03.