线粒体自噬相关蛋白的检测方法

与其他自噬类似，线粒体自噬在正常稳态情况下，发生水平较低，相关靶点比较难检测。因此我们需要使用一些化合物来刺激样本，促进线粒体自噬的发生，进而检测相关蛋白。以PINK1和BNIP3为例：

1）PINK1

PINK1由581aa组成，分子量约为63kDa。前面也讲到在稳态条件下线粒体上的PINK1会被切割水解，根据切割位点不同，会产生~52kDa或~48kDa截短形式。因此在正常生理条件下，PINK1全长形式存在较少。

➣PINK1蛋白的结构及剪接机制

在自噬诱导条件（CCCP处理）下，PINK1不能易位到线粒体内膜，阻断了蛋白切割过程。PINK1与线粒体外膜复合物（TOM）相互作用并稳定在线粒体外膜上。FL-PINK1在线粒体膜上积累，在WB实验中可看到条带增强。

PINK1蛋白的WB检测

注：CCCP是一种强效的线粒体氧化磷酸化解偶联剂，促使线粒体内膜对H+产生通透性，导致线粒体内膜两侧的膜电位丧失，诱导线粒体自噬

2）BNIP3L/NIX和BNIP3

BNIP3L首先被发现为一种促凋亡的BCL2家族蛋白，可诱导细胞凋亡或坏死；不过最近的研究发现，BNIP3L可通过自噬促进网织红细胞的线粒体消除。

BNIP3与BNIP3L/NIX具有60%的同源性，基本结构和功能相似；在缺氧条件下BNIP3L/NIX和BNIP3会被转录激活，通常以同源二聚体的形式锚定在线粒体外膜，促发线粒体自噬。使用Cobalt Chloride模拟低氧也可以达到此作用。

线粒体自噬研究的文献案例 

在国家自然科学基金项目等资助下，广州医科大学团队在线粒体自噬维持心血管稳态方面取得进展，研究成果以“一氧化氮通过MCM8介导的线粒体自噬在川崎病模型中的心血管保护作用”为题，在《自然“心血管研究》 (Nature Cardiovascular Research) 杂志上发表。

➤研究背景

川崎病也称为黏膜-皮肤淋巴综合征，是一种病因不明的急性发热性疾病，表现为系统性血管炎，是5岁以下儿童获得性心脏病的主要病因。

可出现冠状动脉扩张或动脉瘤等，在中国、日本和韩国等东亚儿童中高发。但川崎病的发病机制及冠状动脉瘤发生的遗传学基础尚不清楚。

➤研究方法

机制研究发现抑制一氧化氮(NO)合成会加重川崎病动物模型的症状，NO缺乏抑制了E3泛素酶对MCM8的泛素化，造成MCM8-MCM9 复合体无法解离，阻碍MCM8在线粒体的定位而抑制线粒体自噬功能，进而激活cGAS-STING-I型干扰素通路，导致冠状动脉血管炎；激活NO通路可以促进MCM8介导的线粒体自噬，发挥心血管保护作用。

研究还发现东亚人群中存在的MCM8-P276变异可引起线粒体自噬下降，导致cGAS-STING-I型干扰素通路过度激活，与川崎病的易感性有关。

➤研究结果

该研究提示通过靶向增强MCM8介导的线粒体自噬或抑制I型干扰素通路过度激活，可以改善川崎病冠状动脉炎，为川崎病的治疗提供了新思路。