分子生物学|高分辨率无创胎儿外显子组筛查

胎儿基因诊断可指导临床治疗，并为精准医疗建立基础。无创产前检测通过检测非整倍体及与产前诊断相关的少量变异，使胎儿筛查发生巨大改变，但全面基因检测仍需要羊膜腔穿刺等有创操作。本文介绍了一种有可能广泛应用的高分辨率无创产前筛查方法，该方法通过循环游离DNA（cfDNA）检测胎儿整个外显子组（图1）。

图A显示从母体血浆提取游离DNA（cfDNA），以及之后的外显子组捕获过程。我们生成51个不同胎龄的文库，并计算每个样本中的胎儿cfDNA浓度（胎儿cfDNA÷总cfDNA）。在右侧箱线图中，粗体横线表示在妊娠早、中、晚期的中位数，方框表示四分位距，圆圈表示单个数据点；线表示范围内的最小值和最大值（用第一个四分位数减去四分位距的1.5倍，再将相同数值加上第三个四分位数）。图B说明在考虑胎儿cfDNA占比基础上开发的新型变异检测方法，图中根据cfDNA中母体和胎儿基因型组合显示每个位点上相应特有等位基因比例。每个簇代表一个特有母胎基因型组合。簇根据母体和胎儿DNA直接外显子组测序得出的基因型着色。这些数据凸显出在较低覆盖度和胎儿cfDNA比例下，母体杂合位点上发生簇重叠，此外无论胎儿cfDNA比例如何，均可清晰分辨新发变异和父源变异（胎儿0/1；母体0/0）。图C描述高分辨率无创胎儿筛查（NIFS）在被转诊接受有创检测的14名孕妇中的原理验证应用，以及临床关注的代表性变异，包括与常染色体显性遗传Stickler综合征相符的一个小颌畸形胎儿COL2A1中一处可能的致病性剪接变异（NC_000012.12:g.47982610C→T），一个多发性先天畸形胎儿7号染色体上的一处4-MB致病性缺失（NC_000007.14:g.155368937-159327017del），以及与苯丙酮尿症风险相关的一处携带者PAH变异（NC_000012.12:g.102866632C→T）。所有变异均经过正交验证。WES表示全外显子组测序。

在51名孕妇中评估了高分辨率无创产前筛查的可行性，这些孕妇在入组参与者的医院具有代表性。孕妇孕龄涵盖妊娠早、中晚期，其中5名孕妇处于妊娠早期，9名处于妊娠中期，37名处于妊娠晚期。胎儿cfDNA占比（即来自胎盘或胎儿的游离DNA比例）为6%~51%。我们捕获并测序了22,995个基因，平均覆盖度为210×。我们利用基于机器学习的流程发现单核苷酸变异（SNV）和插入或缺失（indel）（该流程对胎儿cfDNA比例和cfDNA的其他序列特征建模），并探索拷贝数变异（CNV）读取深度。

比较了在11个胎儿和28名母亲的高分辨率无创产前筛查中发现的变异与通过匹配胚系外显子组测序发现的变异。该方法在发现SNV，尤其是新发SNV（仅次于非整倍体的最大一类有临床意义变异）和父系遗传SNV方面非常灵敏（灵敏度中位数，96.3%）。这一结果对于不同的胎儿cfDNA比例非常稳健（灵敏度，92.6%~97.1%；阳性预测值，87.9%~92.2%）。总体而言，胎儿SNV基因型能够以相对较高灵敏度与母体基因型相区分，但我们发现，如果母体是杂合子，则准确度会在胎儿cfDNA占比较低时下降（范围，65.6%~93.2%）。关于indel（在高分辨率无创产前筛查和标准外显子组测序中，其错误发现率高于SNV），我们发现对于新发indel和父系遗传indel，灵敏度中位数为81.9%（范围，66.4~84.6），而对于母系杂合遗传变异，灵敏度中位数为71.3%（范围，51.7~77.8）。在对照胚系外显子组测序进行过滤之前，高分辨率无创产前筛查对SNV灵敏度为99.7%，对indel灵敏度为93.9%，这一结果提示，随着这些方法进一步发展，有可能达到更高灵敏度。由于该队列中大片段CNV数量较少，因此无法对这一变异类别进行基准测试。我们还发现，在28名母亲的582,839个经胚系外显子组测序确认的变异中，高分辨率无创产前筛查能够对母体变异进行高灵敏度基因分型（灵敏度，98.3%），这一结果凸显将该方法用于携带者筛查的潜力。

在被转诊接受标准诊断检查的14名孕妇中评估了高分辨率无创产前筛查实用性，无创产前筛查检测出有创检测所发现的100%变异（6例中的6例）（图1）。结果包括：一个多发性畸形胎儿的一处新发CNV（NC_000007.14:g.155368937-159327017del），一个小颌畸形胎儿COL2A1中的一处剪接变异（NC_000012.12:g.47982610C→T），CFTR中一处与囊性纤维化相关的纯合p.Phe508del变异（NC_000007.14:g.117559592_117559594del）。应用该方法进行的携带者筛查在57.1%的母亲中检测出可报告变异，这一结果与标准筛查结果相似。所有样本性别均可准确推断，包括一些复杂病例，如一个女胎有一个消失的男孪生子，一名母亲曾接受过来自男性捐献者的干细胞移植（图S3）。

这些结果提示，高分辨率无创产前筛查可在核苷酸级分辨率对胎儿各胎龄新发变异进行稳健筛查，并有可能在胎儿cfDNA占比超过15%~20%时检测出母系遗传和隐性疾病变异。该方法还可进行准确的携带者筛查，并检测出可报告的偶然发现（如BRCA2风险变异），有必要为这些发现制定类似于有创产前检测的报告指南。此项原理验证分析提示，通过已经在胎儿非整倍体检测中常规采集的母体血浆样本可以进行胎儿外显子组筛查。