IF=64.5！癌症是一种代谢疾病！揭示精氨酸驱动代谢重编程促进肝癌生长

代谢重编程是癌症的一个标志，但代谢重编程的机制以及代谢改变如何增强致瘤性尚不清楚。

过去的研究进展表明，癌症是一种代谢紊乱，几种主要的代谢途径被重编程以增强细胞增殖。改变的代谢途径包括碳水化合物、氨基酸、核苷酸、脂肪酸和脂质代谢。但是代谢重编程在癌症中的上游机制和下游目标在很大程度上是未知的。

氨基酸代谢重编程在癌症中很常见。例如，精氨酸合成的限速酶——精氨酸琥珀酸合成酶1 (arginine succinate synthetase 1, ASS1)常在肿瘤中的表达发生改变。在一些癌症中过度表达，包括结肠癌、肺癌、胃癌和卵巢癌，但在其他癌症中缺失，如肾细胞癌(RCC)、黑色素瘤、前列腺癌和肝细胞癌(HCC)。尽管对ASS1有相当多的关注，但对肿瘤中的精氨酸水平知之甚少。

近日，巴塞尔大学Michael N. Hall实验室领衔在Cell杂志（IF=64.5）发表了题为“Arginine reprograms metabolism in liver cancer via RBM39” 的研究文章，作者发现肝癌组织中的代谢物含量和代谢途径与正常肝脏组织存在显著差异，肝癌细胞对精氨酸的需求和依赖性增强，大量的精氨酸与其结合蛋白RBM39能够通过正反馈促进精氨酸的吸收，调控肝癌细胞的代谢重编程而促进肝癌细胞的生长和增殖，而抑制RBM39活性可以阻碍肝癌细胞的生长和增殖，抑制小鼠和人源肝癌组织的形成。本研究揭示了肝癌发生过程中会发生以精氨酸为核心的代谢重编程，并探明了“精氨酸-RBM39”信号轴在肝癌代谢重编程中的作用机制，为肝癌治疗提供了新的思路和靶点。

精氨酸水平升高是肝肿瘤发生的必要条件

作者对从mTOR驱动的HCC小鼠模型中分离的肝肿瘤进行了非靶向代谢组学分析。在该小鼠模型中，由于肝脏特异性双敲除肿瘤抑制因子TSC1和PTEN(以下简称L-dKO)，组成性高mTOR信号导致20周龄内肝大、肝骨化、脂肪性肝炎和多发高级别HCC的顺序发展。主成分分析(PCA)和分层OPEN ACCESS显示，肿瘤和对照肝组织的代谢谱是不同的聚类，916个代谢物在L-dKO肿瘤中丰度显著改变。

代谢途径富集分析(MPWEA)表明，精氨酸代谢在L-dKO肿瘤中发生了强烈改变。利用靶向液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测量了单个氨基酸的水平，精氨酸水平在L-dKO肿瘤中升高，而所有其他氨基酸的含量不变或降低。这一观察结果令人惊讶，因为肝肿瘤常缺乏精氨酸合成。

图1

L-dKO肿瘤的转录组学和蛋白质组学分析也显示精氨酸代谢普遍失调。在L-dKO肿瘤中，在解毒过量氨的过程中产生精氨酸的尿素循环转录下调。免疫印迹证实尿素循环酶氨甲酰磷酸合成酶1 (CPS1)、鸟氨酸转氨基甲酰基酶(OTC)、ASS1和精氨酸琥珀酸裂解酶(ASL)的表达减少。此外，肝脏肿瘤中尿素循环代谢物鸟氨酸和瓜氨酸减少。抑制尿素循环使细胞依赖于细胞外精氨酸。说明L-dKO肿瘤中精氨酸的合成减少。因此，溶质载体7A家族中介导精氨酸摄取的几种转运蛋白(SLC7A1、SLC7A3、SLC7A4、SLC7A6、SLC7A7和SLC7A9)在L-dKO肿瘤中被转录上调。离体精氨酸转运试验证实，肝肿瘤中精氨酸摄取增加。因此，L-dKO肿瘤增加精氨酸摄取以补偿精氨酸合成的下调。

图S1

L-dKO和对照小鼠从8周龄至20周龄分别饲喂含有10%或1%标准饲料中正常精氨酸水平(100%精氨酸)的饲料。对照小鼠肝体重比未受到精氨酸限制的影响。减少精氨酸并没有限制L-dKO小鼠的肝脏生长。但精氨酸限制饮食显著降低了肿瘤负荷。因此，高水平的细胞精氨酸对肝脏肿瘤的发展至关重要。

与正常饮食条件下的对照组小鼠的正常肝组织相比，L-dKO小鼠的非肿瘤肝组织中的精氨酸水平也更高。这可能是L-dKO小鼠在整体受损的肝脏中发展出多个可见的肿瘤和许多微观肿瘤，因此无法完全分离出非肿瘤组织。然而限制饮食精氨酸后，L-dKO小鼠非肿瘤肝组织中的精氨酸水平显著降低，但在所有肿瘤中仍升高。表明高水平的细胞精氨酸对致瘤性至关重要。

ARG1和AGMAT的缺失保留了致癌精氨酸水平

精氨酸是多胺的前体，将精氨酸转化为多胺需要消耗大量精氨酸。细胞生长所必需的多胺主要的种类是腐胺、亚精胺和精胺，在各种癌症中水平升高。L-dKO小鼠肿瘤中多胺代谢酶的表达发生改变。重要的是，精氨酸酶1 (ARG1)和agmatinase (AGMAT)通过两条平行途径催化精氨酸到多胺的转化，二者在L-dKO肿瘤中转录下调。ARG1在尿素循环的最后一步裂解精氨酸生成尿素和鸟氨酸。

然后鸟氨酸脱羧酶(ODC)使鸟氨酸脱羧产生腐胺。在平行的、不太为人所知的途径中，一种未知的酶使精氨酸脱羧产生agmatine，然后AGMAT将其转化为腐胺。亚精胺合成酶(SRM)和精胺合成酶(SMS)在L-dKO肿瘤中转录上调，它们依次从腐胺中产生亚精胺和精胺。其他多胺代谢酶的蛋白水平没有变化。

图2

通过荧光测定和非靶向代谢组学检测发现L-dKO肿瘤中总多胺水平升高。ARG1和AGMAT在L-dKO肿瘤中下调，限制精氨酸饮食并没有降低L-dKO肿瘤中的多胺水平，表明积累的多胺不是来自内源性精氨酸库，而是来自增加的多胺摄取。肝肿瘤中腐胺摄取确实增加。因此，细胞内多胺池和精氨酸池是不耦合的，表明肿瘤不是通过积累精氨酸来产生多胺。

图S2

作者推测ARG1和AGMAT的缺失，即精氨酸消耗减少，保留了高水平的精氨酸，精氨酸对肝脏肿瘤的发展至关重要。首先通过免疫组化(IHC)证实了ARG1和AGMAT表达的缺失仅限于肿瘤。接下来对12周龄和16周龄的L-dKO小鼠的肝脏进行了免疫组织免疫反应，确定ARG1和AGMAT的表达在肿瘤发展早期下降。12周是L-dKO肝脏中可以检测到明确肿瘤的最早时间点。在12周龄和16周龄L-dKO小鼠的肿瘤中，ARG1和AGMAT的表达已经降低。因此ARG1和AGMAT的下调是肝肿瘤发生的早期关键事件，可能是为了保持高水平的精氨酸。作者给8周龄的L-dKO和对照小鼠注射了表达ARG1 (AAV-ARG1)或AGMAT (AAV-AGMAT)的肝细胞特异性腺相关病毒(AAV) 验证这一观点。

所有注射AAV的L-dKO小鼠都出现肝脏肿大，但注射AAV-ARG1或AAV-AGMAT的L-dKO小鼠的每只肝脏肿瘤明显少于注射对照病毒的小鼠。注射AAV后，ARG1或AGMAT的过表达仅在L-dKO小鼠的非肿瘤肝组织中检测到，而出现的少数“逃逸”肿瘤则表达低水平的ARG1和AGMAT。重要的是，注射AAV-ARG1或AAV-AGMAT降低了非肿瘤组织中的精氨酸水平，但在少数逃逸性肿瘤中没有，再次表明高精氨酸水平与致瘤性之间存在很强的相关性。AAV-ARG1和AAV-AGMAT对对照组小鼠正常肝组织、L-dKO小鼠非肿瘤组织中的多胺水平以及L-dKO肿瘤中升高的多胺水平均无影响。研究结果表明ARG1和AGMAT被抑制以减少精氨酸的消耗，从而维持肿瘤发生所需的高水平未代谢的精氨酸。低ARG1和AGMAT表达可视为高精氨酸状态。

精氨酸决定了代谢基因的表达

作者筛选了一组缺乏ARG1、AGMAT和精氨酸合成酶的人肝癌细胞系研究未代谢的精氨酸在HCC中的作用，选择了SNU-449细胞系作为L-dKO肿瘤的体外实验系统。使用慢病毒系统在这些细胞中稳定表达ARG1、AGMAT或ARG1和AGMAT(ARG1/AGMAT)。ARG1和/或AGMAT的表达在标准DMEM细胞培养基中轻度降低SNU-449细胞的克隆生长，DMEM含有超生理浓度的精氨酸。

在含有生理浓度类似于血浆或肿瘤微环境(TME)的精氨酸培养基中，ARG1或AGMAT的表达显著降低SNU-449细胞的克隆生长，而ARG1/ AGMAT的共表达抑制了细胞的生长。SNU-449细胞表达ARG1或AGMAT显示精氨酸水平降低，而ARG1/AGMAT的共表达进一步降低了精氨酸水平。但ARG1和/或AGMAT的表达没有增加总多胺水平。综上，SNU-449细胞可以作为在体外研究精氨酸致癌作用的代表。 

图S3

ARG1和AGMAT控制的精氨酸水平独立于精氨酸合成的限速酶ASS1。首先，在SNU-449亲本细胞或ARG1/ AGMAT表达细胞中，ASS1的过表达不会增加精氨酸水平或影响克隆生长，可能是因为SNU-449细胞中其他三种精氨酸合成酶的表达受到抑制。其次，ARG1/AGMAT的表达减少了SNU-449细胞的肝球形成，敲除ARG1或AGMAT增加了Huh7细胞的克隆生长。而ASS1在肝球和Huh7细胞中的表达升高。

作者在有或无高水平精氨酸或几种精氨酸相关代谢物的情况下培养表达ARG1/ AGMAT的SNU-449细胞。发现只有生理形式的L-精氨酸，而不是其他相关代谢物(D-精氨酸；刀豆氨酸；精氨酸，乙酰精氨酸或甲基精氨酸；或精氨酸上下游的代谢物：如瓜氨酸、鸟氨酸、胍丁氨酸、尿素和肌酸)，恢复了表达ARG1/ AGMAT的SNU-449细胞的生长。因此，未代谢的精氨酸促进了癌细胞的生长。

图3

据报道，精氨酸影响免疫细胞和癌细胞的代谢。在T细胞中，精氨酸增强氧化磷酸化(OXHPOS)和核苷酸合成；在平滑肌肉瘤和黑色素瘤细胞系中，精氨酸饥饿减少糖酵解，增强OXPHOS和丝氨酸合成；相反，在ASS1阴性的乳腺癌细胞系中，精氨酸剥夺会减少OXPHOS，从而导致线粒体功能障碍；在前列腺癌细胞中，精氨酸通过表观遗传调控促进OXPHOS基因的表达。因此研究升高的精氨酸是否通过调节代谢基因表达来促进肝癌细胞的代谢重编程。

为了鉴定对精氨酸反应的差异表达基因，作者对表达ARG1/AGMAT的SNU-449细胞和缺乏ARG1/AGMAT的SNU-449对照细胞进行了RNA测序(RNA-seq)。根据RNA-seq, PCA中表达ARG1/ AGMAT的细胞与对照细胞分离。与对照细胞相比，ARG1/AGMAT中有1457个转录本差异表达。PWEA(使用KEGG途径)显示与代谢相关的术语频率很高。发现在ARG1/ AGMAT表达细胞中葡萄糖转运蛋白3 (GLUT3)和己糖激酶2 (HK2)的表达增加。ARG1/AGMAT控制的精氨酸水平影响肝癌细胞的中枢能量代谢以外的代谢。

ARG1/AGMAT的表达也改变了氨基酸、NAD+、核苷酸、脂肪酸和醛代谢等基因的表达。作者在这些改变的代谢途径中定义了一个基因标记，包括天冬酰胺合成酶(ASNS)、丝氨酸生物合成基因-磷酸丝氨酸转移酶1 (PSAT1)和磷酸丝氨酸磷酸酶(PSPH)、谷氨酰胺酶肾异型(GLSK，也称为GLS1)、糖酵解基因GLUT3和HK2、NAD+代谢基因烟酰胺N-甲基转移酶(NNMT)和初级胺氧化酶3 (AOC3)。在表达ARG1/ AGMAT即低精氨酸的细胞中，ASNS、PSAT1、PSPH和GLSK的表达减少，而GLUT3、HK2、NNMT和AOC3的表达增加。

因此，ARG1/AGMAT表达后，ASNS、PSAT1和PSPH蛋白水平降低，而NNMT蛋白水平升高。而过量精氨酸的加入逆转了ARG1/AGMT对特征基因表达的影响。有趣的是，在ARG1和AGMAT被抑制的L-dKO肝肿瘤中，ASNS、PSAT1和PSPH蛋白水平升高，而NNMT蛋白水平降低。ARG1/AGMAT状态与特征基因表达之间的相关性进一步支持了ARG1/AGMAT控制的精氨酸水平决定癌症代谢的假设。总之，精氨酸在转录水平上控制致癌代谢。

精氨酸依赖性ASNS表达进一步增强精氨酸摄取

与对照细胞相比，ASNS是ARG1/ AGMAT表达细胞中差异最大的基因。天冬酰胺可以促进必需氨基酸的吸收。同时负责介导精氨酸摄取的单转运蛋白和反转运蛋白上调。在ASNS被抑制的表达ARG1/ AGMAT的SNU-449细胞中精氨酸摄取减少。天冬酰胺可以恢复细胞对精氨酸的摄取，促进ARG1/AGMAT表达细胞的克隆生长。因此，肝肿瘤中精氨酸摄取的升高似乎依赖于ASNS衍生的天冬酰胺。在表达ARG1/AGMAT的SNU-449细胞中，ASNS的稳定表达足以增加精氨酸摄取，并以精氨酸依赖的方式恢复SNU-449细胞的克隆生长。此外，增加精氨酸的摄取也恢复了特征基因的表达。在ARG1/AGMAT表达ASNS的细胞中，PSAT1、PSPH和GLSK表达增加，GLUT3、HK2、NNMT和AOC3表达降低。

图S4

综合应激反应(ISR)的转录因子ATF4会增强ASNS的表达，而ATF4在癌症中通常是活跃的。除ASNS外，ATF4和ATF4靶基因在ARG1/ AGMAT表达细胞中均无差异表达。表明ISR不足以增强ASNS表达，即需要额外的精氨酸依赖因子。

作者使用肝细胞特异性AAV敲除8周龄L-dKO小鼠的ASNS来评估ASNS高表达对体内肿瘤发生的重要性。之前的体内实验在非肿瘤组织中检测到ASNS敲低，而在肿瘤组织中未检测到ASNS敲低。ASNS敲除后，非肿瘤组织中的精氨酸水平降低，而肿瘤组织中的精氨酸水平升高，L-dKO小鼠的肿瘤负荷减轻。总之，ARG1和AGMAT的缺失增强了精氨酸的积累，导致ASNS依赖精氨酸的表达。ASNS衍生的天冬酰胺进一步增强精氨酸的摄取。上述结果表明，高水平的精氨酸在一定程度上通过代谢重编程促进了肿瘤的发生。

图4

精氨酸特异性结合RBM39

一项在T细胞中的研究表明精氨酸可能与精氨酸结合蛋白相互作用，从而控制代谢基因的表达。假设这种机制可能也存在于肝癌细胞中，作者用精氨酸偶联小珠进行了下拉实验鉴定潜在的精氨酸结合蛋白。结果表明能够纯化已知的精氨酸传感器CASTOR1。用L-dKO肿瘤和SNU-449细胞裂解物进行下拉实验，用过量精氨酸洗脱蛋白质，并用质谱(MS)分析。在L-dKO肿瘤和SNU-449裂解物的下拉蛋白中分别显著富集349种和461种蛋白。

接下来敲除了42个与转录、剪接或信号传导相关的候选基因，并评估了SNU-449细胞中的ASNS表达。敲低RBM39显著降低ASNS表达。RBM39，也称HCC1和CAPERα，是一种必需的富含精氨酸-丝氨酸的RNA结合蛋白，参与mRNA前体剪接和转录共激活或共抑制。通过免疫印迹证实，RBM39可以用精氨酸偶联珠从L-dKO肿瘤和SNU-449细胞中纯化出来。从哺乳动物细胞或细菌中免疫纯化的重组RBM39结合放射标记的精氨酸，这种方式可以有效地与过量的“冷”L-精氨酸竞争，而不能与赖氨酸或D-精氨酸结合。因此，精氨酸特异性结合RBM39。

图S5

RBM39包含一个N端富精氨酸-丝氨酸(RS)结构域、两个RNA识别基序结构域(RRM1和RRM2)和一个C端U2AF同源基序结构域(UHM)。作者在大肠杆菌中表达了重组RBM39片段以鉴定RBM39的精氨酸结合区。只有含有RS结构域的N端片段RBM39(1-244)结合精氨酸偶联小珠和放射性标记的精氨酸。同样，结合是特定于L-精氨酸的，而亮氨酸、赖氨酸或D-精氨酸不能从精氨酸偶联小珠中洗脱RBM39(1-244)，也不能与放射性标记的精氨酸竞争与RBM39(1-244)的结合。表明精氨酸特异性结合RBM39的N端区域，很可能是RRM1结构域的N端区域，至少促进了ASNS的表达。

图5

精氨酸结合的RBM39控制代谢基因的转录

在SNU-449细胞中，瞬时小干扰RNA (siRNA)介导或稳定短发夹RNA (shRNA)介导的RBM39敲低会降低PSAT1、PSPH和GLSK的表达，增加GLUT3、HK2、NNMT和AOC3的表达。Indisulam是一种 “分子胶”，可将RBM39转化为DCAF15相关泛素连接酶复合物的新底物，从而诱导RBM39的特异性蛋白酶体降解。10mM Indisulam处理SNU-449细胞可降低RBM39蛋白水平，同时降低ASNS、PSAT1、PSPH和GLSK，增加GLUT3、HK2、NNMT和AOC3，但不影响ATF4表达。

在表达ARG1/AGMAT的细胞中，Indisulam还进一步加重了特征基因的表达改变，并阻断了ARG1/AGMAT表达细胞中ASNS重新表达的作用。添加过量的天冬酰胺(即增加精氨酸摄取)不能恢复稳定敲低RBM39的SNU-449细胞的克隆生长，而且RBM39的过表达也不能恢复表达ARG1/AGMAT的SNU-449细胞的特征基因表达。这些发现表明RBM39以精氨酸依赖的方式控制代谢基因的表达。

图S6

接下来进行RNA测序以确定RBM39控制代谢基因表达的范围。将Indisulam治疗和siRNA介导的RBM39敲低结合起来，Indisulam增加了RBM39 mRNA水平，而单独使用siRNA介导的RBM39敲低是不完整的。7113个转录本在RBM39缺失的细胞中差异表达。为评估差异表达基因中有多少可能通过RBM39受到精氨酸的调控，比较了受精氨酸限制(即ARG1/AGMAT表达) 与RBM39缺失细胞的前2500个基因的表达。2500个基因中有907个(36%)在RBM39缺失的细胞中同样存在差异表达。RBM39缺失与精氨酸缺失(通过ARG1/AGMAT表达)一样，改变了葡萄糖、丙酮酸、氨基酸、NAD+、核苷酸、脂肪酸和醛代谢中的基因表达。因此，精氨酸似乎通过RBM39广泛控制代谢基因的表达。

通过对SNU-449细胞的RNA-seq数据集进行差异选择性剪接分析，研究了RBM39是否通过mRNA前体剪接或转录控制代谢基因的表达。在SNU-449细胞中，ARG/ AGMAT的表达(即精氨酸限制)不影响剪接。RBM39缺失导致许多前mRNA的选择性剪接，但是并不影响代谢特征基因的剪接，表明RBM39通过转录控制代谢基因的表达。作者使用ASNS和PSAT1启动子区域进行荧光素酶启动子活性测定。Indisulam消耗RBM39和稳定敲低RBM39可降低ASNS和PSAT1启动子活性。ARG1/AGMAT的表达也降低了ASNS和PSAT1启动子的活性，再次表明精氨酸和RBM39控制着代谢基因的转录。

图6

在SNU-449细胞中表达RBM39野生型和突变型。如重组flag标记的全长RBM39；RBM39缺乏N端精氨酸结合区(称为RBM39ΔN)。重组G268V突变RBM39产生Indisulam抗性。在RBM39ΔN和RBM39ΔN- NLScMYC SNU-449细胞中，ASNS的表达减少，但在表达全长RBM39的细胞中ASNS的表达没有减少。RBM39精氨酸结合缺陷突变体使ASNS和PSAT1启动子活性降低。因此，RBM39需要其精氨酸结合域来控制代谢基因的表达。表达精氨酸结合缺陷RBM39的SNU-449细胞中，Indisulam的存在降低了克隆生长。N末端的缺失可以影响RBM39的功能，从而影响克隆生长，而不依赖于精氨酸的结合。

RBM39促进肿瘤发生

RBM39在L-dKO肿瘤中的表达升高。使用肝细胞特异性AAV敲除8周龄L-dKO小鼠的RBM39研究其是否在肿瘤发生中起重要作用。RBM39敲低降低了L-dKO小鼠的肿瘤负荷。此外，RBM39的敲低与非肿瘤组织中ASNS mRNA和精氨酸水平的降低相关。支持RBM39转录控制ASNS进而促进精氨酸摄取的观点。用Indisulam治疗16周龄的L-dKO小鼠，Indisulam治疗降低了L-dKO肿瘤中RBM39蛋白水平，也逆转了精氨酸诱导的RBM39对ASNS和其他代谢酶表达的影响。综上所述，精氨酸结合的RBM39通过转录重编程代谢从而促进致瘤性。

RBM39是HCC中代谢重编程和肿瘤进展所必需的

作者分析了肝癌患者肝肿瘤和邻近非肿瘤组织活检的蛋白质组和转录组，HCC活检显示尿素循环抑制，几种精氨酸转运蛋白上调，多胺生物合成酶失调。最重要的是，HCC中ARG1和AGMAT的表达降低，RBM39和ASNS的表达升高。这些改变在去分化的侵袭性肿瘤中尤为明显，与侵袭性肝癌小鼠模型表型一致。免疫印迹证实，肝癌患者肿瘤中ARG1和AGMAT缺失，RBM39和ASNS水平升高。对100多个HCC样本的组织微阵列分析证实了ARG1和AGMAT在HCC中的显著缺失。早期HCC的转录组分析显示ARG1和AGMAT下调，RBM39和ASNS上调。支持了ARG1和AGMAT的缺失，通过RBM39上调ASNS的假设，这是HCC的早期事件。基于TCGA肝癌数据集的研究发现，ARG1和AGMAT的缺失与生存率降低相关。

图S7

11对肿瘤和非肿瘤患者活检的非靶向代谢组学显示，尿素循环代谢物鸟氨酸和瓜氨酸减少，精氨酸和乙酰化多胺增加。通过生化方法证实在10对肿瘤和非肿瘤组织的独立队列中精氨酸和总多胺增加。下拉实验确定人类肝癌组织中潜在的精氨酸结合蛋白。在精氨酸偶联微球下拉后，289个蛋白显著富集，RBM39作为精氨酸结合蛋白在三个HCC样本的裂解物中被检测到。

图7

最后作者用Indisulam治疗了20例患者来源的肝细胞癌类器官。Indisulam以剂量依赖性的方式降低了所有20种类器官的生长。有趣的是，与索拉非尼(一种用于晚期HCC53的多激酶抑制剂)相比，Indisulam的半抑制浓度(IC50)较低。表明消耗RBM39可能是HCC的一种治疗选择。总之结果表明，在小鼠肿瘤和人SNU-449细胞中的发现可转化为HCC患者，且肝癌的精氨酸-RBM39依赖性可用于芳基磺胺类药物治疗。