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铁死亡（ferroptosis）是细胞程序性死亡的一种方式，由于细胞内铁离子的累积和氧化应激的增加，导致脂质过氧化产物的产生，进而引发细胞膜的破坏和细胞死亡。

在恶性肿瘤中，铁死亡的抑制被认为是肿瘤细胞的一种适应性机制，以促进其生存和增殖。一些研究表明，通过调控细胞内铁离子水平和氧化应激的平衡，可以促进肿瘤细胞的铁死亡，从而增强抗肿瘤效应。铁死亡诱导剂在肿瘤治疗中显现出潜在的应用价值。

今天给大家分享一篇于近期发表在Science Advances（IF=13.6/Q1）的高分文章，题目为“NRF2 controls iron homeostasis and ferroptosis through HERC2 and VAMP8”，揭示了NRF2通过HERC和VAMP8调控卵巢癌细胞铁稳态和铁死亡的新机制。

该文章为亚利桑那大学药学院Donna D. Zhang团队联合哥伦比亚大学和耶鲁大学医学院团队合作发表，利用CRISPR-Cas9技术、活细胞荧光成像、ChIP-PCR、生物素-DNA Pulldown、电子顺磁共振等方法，研究发现：

NRF2通过控制HERC2（NCOA4和FBXL5的E3泛素连接酶）和VAMP8（介导自噬体-溶酶体融合）来维持铁稳态。抑制NRF2以增加细胞内不稳定铁池（LIP），可引起卵巢癌细胞铁死亡，抑制恶性肿瘤进展，具有临床转化意义和价值。

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研究背景

转录因子核因子红细胞2相关因子2（NFE2L2/NRF2）是一种在细胞中起重要作用的转录因子，主要参与调控许多抗氧化应激和细胞解毒反应基因的表达。当细胞受到氧化应激、炎症或其他损伤因素的刺激时，NRF2会被激活并进入细胞核，与特定的DNA序列结合，促进氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）等效应物产生，从而清除氧自由基、减轻氧化应激对细胞的损伤。

在正常组织中，NRF2通过与KEAP1（E3泛素连接酶复合物的接头）相互作用而保持较低水平，KEAP1可靶向NRF2介导泛素化和随后的蛋白酶体降解。通常情况下，NRF2的受控激活可防止化学致癌剂诱导的癌症发生。然而，当KEAP1发生突变引起NRF2过度表达，则会促进肿瘤增殖、转移并产生耐药性。临床上，患者肿瘤中NRF2的高表达与不良预后密切相关。

癌症治疗的障碍之一是获得性耐药，即肿瘤细胞对促凋亡信号逐渐不敏感。而对肿瘤细胞进行铁死亡诱导的方法具有治疗侵袭性、耐药性和转移性癌症患者潜力。铁死亡的发生由多种关键蛋白参与，如系统Xc-蛋白（SLC7A11）、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）、铁离子转运蛋白等。不稳定铁池（LIP）是影响铁死亡的因素之一，LIP是细胞内铁代谢的中间库，主要由游离铁离子（Fe2+）组成，能够更加活跃地参与氧化还原反应和生成活性氧。LIP的积累过高可引起过度氧化应激，导致细胞死亡。

主要内容

本研究涉及的调控因子为NRF2、E3泛素蛋白连接酶2（HERC2）、核受体辅激活因子4（NCOA4）、囊泡相关膜蛋白8（VAMP8）、铁蛋白组件（FTH1/FTL）、铁调蛋白（IRP2）。在该机制中：

🔎1.HERC2是NRF2的靶基因，NRF2的缺失导致HERC2表达减少；

🔎2.HERC2为FBXL5和NCOA4的E3泛素连接酶，HERC2下调增加了FBXL5和NCOA4稳定性；

🔎3.NRF2的缺失使得IRP2蛋白稳定性降低，FTH合成增强

🔎4.NRF2通过mTOR-TFEB轴间接调控VAMP8；

🔎5.VAMP8下调导致自噬体-溶酶体融合受阻并抑制铁蛋白自噬；

🔎6.NCOA4过度积累招募脱铁铁蛋白并在自噬体中积累，增加LIP并增强细胞对铁死亡的敏感性。

研究结果

⏩1. NRF2缺失增加卵巢癌细胞的铁死亡敏感性

为了确定NRF2在介导卵巢癌细胞抵抗铁死亡中的作用，研究团队首先利用CRISPR-Cas9基因编辑技术建立了三个NFE2L2/NRF2 KO SKOV-3卵巢癌细胞系。抑制系统xc-的铁死亡诱导剂IKE处理可显著诱导NRF2 KO细胞发生铁死亡，且细胞活力显著下降、观察到较高水平的脂质过氧化物和ROS水平。利用铁螯合剂去铁胺DFO和脂质过氧化抑制剂铁他汀1 Fer-1则可以完全消除IKE诱导的细胞铁死亡，但泛半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-fmk无逆转效果，表明游离铁积累和脂质过氧化在促进铁死亡中的重要性。

⏩2. NRF2缺失破坏铁稳态，并通过耗尽其靶基因HERC2增加LIP

由于细胞铁死亡需要游离铁（Fe 2+）来驱动，因此研究团队使用Ferene-S的比色测定法测定了细胞内Fe 2+浓度，发现NFE2L2/NRF2 KO细胞中Fe 2+水平显著上升，且IKE处理可进一步提高Fe 2+水平。通过免疫荧光对上述结果进行验证，结果一致。此外，NFE2L2/NRF2 KO改变了许多参与铁蛋白合成和降解的蛋白质的表达，出现HERC2和IRP2下调，FBXL5和铁蛋白重链/轻链（FTH1和FTL）增加，这会反过来可影响LIP。

由于FBXL5-IRP2介导的铁蛋白合成和通过自噬-溶酶体途径的NCOA4依赖性铁蛋白降解都可以由关键的E3泛素连接酶HERC2控制，且NFE2L2/NRF2 KO中发生HERC2蛋白水平降低，团队通过双荧光素酶报告基因实验和ChIP-PCR进一步探究了HERC2作为NRF2靶基因的可能性，并验证HERC2中受NRF2调控的功能性抗氧化反应元件（AREs）。

图3.NRF2缺失会损害铁稳态，并通过去除其靶基因HERC2来增加LIP

⏩3. VAMP8在NFE2L2/NRF2 KO细胞中下调导致铁蛋白自噬缺陷以及脱铁铁蛋白/NCOA4自噬体积累

在NFE2L2/NRF2 KO细胞中FTH1、FTL和NCOA4的蛋白水平增加，表明铁蛋白降解存在缺陷。研究团队进一步利用mRFP-GFP探究了这些蛋白质的增加是否为自噬流受阻所导致，结果发现NFE2L2/NRF2 KO细胞的自噬体形成并没有缺陷，而是在该通路的后期被阻断。

接着，团队检测了在自噬体-溶酶体融合中发挥关键作用溶酶体SNARE复合物（由VAMP8、SNAP29和STX17组成）水平，结果发现VAMP8水平显着降低，但STX17和SNAP29水平没有明显变化。

溶酶体基因的转录受转录因子EB（TFEB）的调节，TFEB活性由上游激酶作用其丝氨酸磷酸化控制。而在NFE2L2/NRF2 KO细胞中发现TFEB磷酸化和核排斥导致铁蛋白自噬阻断，从而降低铁蛋白的转录；同时，上游激酶mTOR被激活，导致VAMP8转录减少，最终阻断了铁蛋白自噬流。

进一步地，研究团队通过免疫荧光分析发现FTH1/FTL被NCOA4招募到自噬体中，但由于缺少VAMP8介导，自噬体-溶酶体融合被阻断，FTH1/FTL发生积累。此外，NCOA4敲除可缓解NFE2L2/NRF2 KO细胞中LIP增加和铁死亡发生，且明显增强在IKE处理下NFE2L2/NRF2 KO细胞的存活能力。上述结果表明，游离铁的积累很可能不是由于铁蛋白表达的变化而引起。

图4.NFE2L2/NRF2 KO细胞中VAMP8下调导致铁蛋白自噬缺陷和脱铁铁蛋白/NCOA4自噬体积累

⏩4. NFE2L2/NRF2通过HERC2、VAMP8和NCOA4调节铁稳态

上述工作揭示了NRF2先前未被发现的功能，即NRF2通过HERC2、VAMP8和NCOA4调节铁稳态和铁死亡。通过控制蛋白质水平，NRF2调节铁蛋白的合成和降解。

首先，NRF2的缺失导致其靶蛋白HERC2表达下调，FBXL5和NCOA4稳定性增加，IRP2蛋白稳定性降低，FTH合成增强。

其次，NRF2通过mTOR-TFEB轴间接控制VAMP8，在NFE2L2/NRF2 KO细胞中，VAMP8的TFEB依赖性转录减少导致自噬体-溶酶体融合受阻并抑制铁蛋白自噬。

第三，NFE2L2/NRF2 KO细胞中NCOA4的过度积累会导致脱铁铁蛋白募集到自噬体中，使得脱铁铁蛋白/NCOA4在自噬体中积累，LIP增加，并增强对铁死亡细胞死亡的敏感性。

图5.NRF2通过HERC2、VAMP8和NCOA4调节铁稳态

⏩5. NRF2-HERC2和NRF2-VAMP8/NCOA4轴调控铁稳态和决定铁死亡敏感性

为了进一步验证新发现的NRF2功能在铁稳态中的贡献，研究团队构建了HERC2和VAMP8单或双KO细胞。结果发现，HERC2或VAMP8 KO均导致FTH1和NCOA4以及铁死亡标记物COX2和4-HNE的蛋白水平增加，增加了细胞铁死亡发生，其中HERC2/VAMP8的双KO表现出更明显的表型优于单一KO。此外，双KO细胞中游离铁水平显着增加，并表现出与NFE2L2/NRF2 KO细胞一致的铁死亡敏感性。

图6.NRF2-HERC2和NRF2-VAMP8/NCOA4轴对铁稳态和决定铁死亡敏感性的影响

为了充分证实NCOA4介导脱铁铁蛋白募集并在自噬体中过度积累到，导致LIP增加和促进铁死亡死亡的这一机制，团队构建了NCOA4 KO NFE2L2/NRF2 WT和NFE2L2/NRF2 KO细胞系。结果发现，NCOA4缺失下调了FTH1、COX2和4-HNE水平，并降低LIP和铁死亡细胞比率。此外，NFE2L2/NRF2 KO SKOV3细胞中VAMP8的过度表达减轻了自噬阻断效应，并使得FTH1、NCOA4和LC3-I/II水平降低。

⏩6. NRF2与癌症组织中HERC2和VAMP8水平以及癌细胞系的铁死亡抗性相关

为评估该研究的转化相关性，研究团队收集了卵巢患者组织样本进行检测。结果发现，NRF2在正常组织中的表达很低，在肿瘤中却被上调。在多种不同的卵巢癌细胞系中，NRF2和HERC2、NRF2和VAMP8之间存在正相关性。此外，大多数癌细胞系中NRF2的水平和FTH1或NCOA4之间呈负相关，但与不同的铁死亡诱导剂的GI50之间存在正相关。且NRF2与其他不诱导铁死亡的细胞毒性化合物的GI50之间没有相关性，因此，NRF2决定了卵巢癌细胞系对铁死亡诱导剂的抗性。

图7.NRF2表达与癌症组织中的HERC2和VAMP8水平以及铁死亡抑制相关

⏩7. NRF2抑制增强临床前模型中细胞铁死亡的敏感性

由于已初步证实NRF2可有效保护卵巢癌细胞免受铁死亡诱导剂的影响，因此研究团队使用临床前模型探索了NRF2抑制剂和铁死亡诱导剂联合干预对引发癌细胞死亡的效果。所用的模型包括三维肿瘤球状体、NFE2L2/NRF2 WT和杂合的SKOV-3异种移植以及分化较差的卵巢癌患者异种移植，检测了小鼠肿瘤的生长速度和铁死亡标记物水平。结果证实了联合NRF2抑制剂和铁死亡诱导剂在卵巢癌治疗中的有效性。

图8.遗传或药理学NRF2抑制增强了临床前模型中对铁死亡细胞死亡的敏感性

研究结论

总的来说，该研究提出了NRF2通过HERC2、VAMP8和NCOA4控制铁蛋白的合成与降解并维持铁稳态的新机制，有助于增加对NRF2抑制和铁死亡诱导的理解，并在临床前模型评估了NRF2抑制剂和铁死亡诱导剂联合干预对癌细胞铁死亡发生的效果和影响，提供了一种新的有效治疗策略。

文章来源：

Anandhan A, Dodson M, Shakya A, et al. NRF2 controls iron homeostasis and ferroptosis through HERC2 and VAMP8. Sci Adv. 2023;9(5):eade9585. doi:10.1126/sciadv.ade9585

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