农杆菌死活摇不起来，但也不像噬菌体污染？

自今年4月左右开始，我所在的实验室开始偶现农杆菌无法摇起来的现象，我和实验室遇到过相关问题的人一起进行了讨论和验证，尽量详细地描述情况，主要如下：

1、最初问题集中于部分保于-80℃的农杆菌按正常流程摇不起来，而且是有时摇起来，有时摇不起来，从开始的失败率10-20%到后来的50-60%甚至更高。有时候一些第一天摇不起来的菌在连续摇至第二、三天会变得浑浊，但其中不少有明显的悬浊物或是菌液颜色不正常（印象中有的偏白，类似被污染），我们不敢再用。我们实验室是用的40%甘油和新鲜菌液1：1混合后保于-80℃（实验室的大肠杆菌和rosseta菌也是一样的保菌流程），摇农杆菌用的是实验室用公司的母液自制的GV3101感受态，目的一般是打烟草（LCI、BiFC等），每次摇菌都是固定流程：取40-50μl保菌菌液加入2-3ml的对应抗性的LB培养基中。出现问题的保菌的菌液部分是4月新保的，但也有不小一部分在今年4月前就已经正常使用多次。然而同时期，实验室的大肠杆菌和rosetta菌液均工作正常，没有出现类似情况。我们尝试重新配制了LB以及涉及到的K+、Spe+和Riff抗生素，也尝试了从其他实验室借到的对应抗生素进行配制，情况并未见明显好转。

2、随后我们怀疑是出问题的保菌菌液因为疏忽没有上下混匀就放进了-80℃，或者是一些保的菌时间太长活性降低导致摇菌失败，于是将失败的菌液全都重新做质粒转化和摇菌保菌，然而并未好转，甚至有刚保的菌第一次接菌就摇不起来的情况。

3、由于实验室从未有过先例，我们查询资料以后，根据之前有出现清澈的培养基里伴随悬浊物的情况，怀疑可能是噬菌体污染，于是迅速对实验室的摇床、超净台等进行了消毒，用的好像是1%的次氯酸钠（具体浓度记不清了），并且进行了一次实验室大扫除，对地面、桌面等也用低浓度的次氯酸钠进行了消毒。不过我们没有按网上建议的停工3-5天，而是大扫除后继续正常工作。大扫除后农杆菌的摇菌情况的确有所好转，失败率降低了很多。因此问题暂时得到了解决。

4、直到9月初开始，我和实验室的另一名师兄发现农杆菌再次出现了类似情况：我连续两次用正常保的菌（保菌时间均在今年第一次农杆菌问题解决后）摇菌失败，失败率一度达90%（八管只摇起一管）。师兄的摇菌失败率也有一半左右。随后第三次的摇菌更为匪夷所思：我用新提的质粒进行同批次GV3101感受态转化，至第三天长出了没有明显异常的单克隆（如图）。

类似这样的板我一共涂了十一个，情况相同（因此我之后初步排除了抗生素、自制感受态等的问题），于是按正常流程挑菌摇菌；同时我将第一、二次摇起的菌分别重新接入LB重新摇菌，共计十八管菌。然而第二天只有四管浑浊菌液，且新转化挑菌的十一管几乎清澈。不死心的我将这些菌液又摇了两天，发现所有新转化挑菌的管中枪头内均出现不明固态物，大概是农杆菌的尸体，这是否说明这些农杆菌确实被摇起来过？（如图）

自此，实验室暂时无人能解答这种现象，而我所学过的所有知识也暂时无法解释这种情况。目前我最大的疑惑在于，如果是农杆菌的独立的问题，例如Riff抗生素或是农杆菌感受态（制备、转化流程）出现了问题，那为什么所有这批新转化涂板的农杆菌能够如图片中正常生长？又或者是这种状态已经有隐藏的问题？另外，实验室除上述条件之外对农杆、大肠杆菌和rosetta的所有条件（LB、保菌条件、抗生素、摇菌的超净台等）均完全一致，如果是噬菌体污染或是LB、甘油、其他抗生素的问题，那为什么实验室的大肠杆菌和rosetta没有出现任何问题？

为了尽快解决这种问题，查阅各种资料后无果，我们尝试来论坛提问。如果有了解类似情况或是发现错误的大佬，还望不吝指教。感谢！